عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية والدبقية من المثانة البولية للفئران

خذ فأرا قتلا.

افتح البطن واستئصال المثانة واغمرها في العازلة.

افتح المثانة وقم بإزالة الدهون الملتصقة وبقايا الأنسجة.

انقل المثانة إلى أنبوب يحتوي على عازلة وجهاز طرد مركزي وإزالة الحطام.

ضع الأنسجة في محلول يحتوي على الكولاجيناز وافرمه. أضف المزيد من الكولاجيناز لتحلل المصفوفة خارج الخلية ، وتخفيف الخلايا.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. أضف التربسين لتعطيل تقاطعات الخلية والخلايا ، وإطلاق الخلايا.

أضف وسائط الشطف التي تحتوي على البروتينات لتعطيل التربسين ، ثم جهاز الطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية.

قم بتعليق الخلايا في الوسائط ؛ قم بتصفيتها لإزالة الركام ، واحصل على تعليق أحادي الخلية.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في الوسائط.

ضع الخلايا على أغطية مغلفة لتسهيل الارتباط بالخلايا العصبية والدبقية. قم بإزالة الخلايا غير المرفقة.

إضافة وسائط الخلايا العصبية التي تحتوي على عوامل النمو لتعزيز النضج الخلوي, إنشاء ثقافة الخلايا العصبية والدبقية الأولية.

ابدأ بوضع الفئران على منشفة جراحية معقمة وتعريض البطن. استخدم المقص والملقط لفتح تجويف البطن والكشف عن المثانة. استخدم مجموعة أخرى من المقصات والملقط لرفع المثانة برفق وقطعها من عنق المثانة.

بعد ذلك ، ضع المثانة بسرعة في محلول كريبس بارد مستقر بالأكسجين لتحسين بقاء الخلايا. أضف محلول كريبس إلى ثلاثة أطباق زجاجية وثلاثة أكواب زجاجية وضعها في حمام جليدي للتبريد المسبق. قم بترقيم الأطباق والأكواب 1 و 2 و 3 لمنع الالتباس.

في الطبق الزجاجي 1 ، افتح المثانة بمقص العيون وافتحها بالملقط ومقسم نواة الملاعق. اشطف المثانة في دورق زجاجي 1 وضعها في طبق زجاجي 2. تخلص من الدهون الملتصقة على سطح الأنسجة باستخدام الملقط ومقص العيون. ثم اشطف المثانة في دورق 2 وضعها في الطبق 3.

اكشط المثانة برفق باستخدام الملقط ومقسم نواة الملاعق لإزالة المرفقات الخارجية. اشطف المثانة في دورق زجاجي 3 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مع 14 مل من محلول كريبس البارد. الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة عند 360 مرة جم و 4 درجات مئوية.

انقل المثانة من أنبوب الطرد المركزي إلى قارورة سعة 2 ملليلتر تحتوي على 1 مليلتر من محلول الهضم. استخدم مقص العيون لتقطيع المثانة إلى قطع صغيرة. امزج محلول المثانة مع 9 ملليلتر من محلول الهضم 1 في طبق زراعة الخلايا المعقم. قم بإجراء عملية الهضم الأولى في حاضنة رج لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 200 دورة في الدقيقة. بعد الهضم الأول ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 300 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.

في هذه الأثناء ، ضع محلول الهضم 2 في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للتسخين المسبق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة معظم المادة الطافية التي تحتوي على محلول الهضم 1 ، مع ترك بعض المواد الطافية لتجنب فقدان الخلايا.

أعد تعليق الخلايا في محلول الهضم الدافئ 2 ورج الخليط أثناء الهضم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بمجرد اكتمال الهضم ، قم بإلغاء تنشيط التربسين على الفور عن طريق إضافة 10 مل من وسائط الشطف البارد. الطرد المركزي للخلايا عند 360 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطاففية للتخلص من جميع التربسين.

أعد تعليق الرواسب برفق باستخدام 3 ملليلتر من وسائط الخلايا العصبية ، مع التأكد من عدم توليد فقاعات هواء في المحلول. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية سعة 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 360 مرة جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. ثم, أعد تعليق الكريات الخلية برفق في 1 ملليلتر من وسائط الخلايا العصبية A وإضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 48 بئر. خلايا زراعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.