تحفيز تمايز الخلايا العصبية باستخدام قضبان الذهب النانوية

ابدأ بالخلايا العصبية المزروعة في وسط تمايز الخلايا.

أضف قضبان نانو ذهبية إلى الوسط.

احتضان للسماح للخلية بابتلاع القضيب النانوي من خلال عملية تسمى الالتقام الخلوي.

تحفيز القضبان النانوية بالليزر.

يثير شعاع الليزر الإلكترونات السطحية على القضيب النانوي. ثم تعود الإلكترونات المثارة إلى الحالة الأرضية ، وتطلق الطاقة الحرارية.

تحفز هذه الحرارة الخلايا العصبية على إنتاج نتوءات مدعومة ببروتين هيكل خلوي محدد يسمى βIII-tubulin.

قم بإزالة الوسط المستهلك.

إصلاح الخلايا. أضف منظفا مناسبا لاختراق الغشاء.

أضف عامل مانع لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.

قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف βIII-tubulin.

أضف الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورسنت والتي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية.

تلطخ النواة بصبغة فلورية زرقاء.

باستخدام الفحص المجهري اللامع ، لاحظ الخلايا ذات اللون الأحمر ذات النوى الزرقاء.

تشير الإسقاطات الممدودة للخلية إلى تمايز الخلايا العصبية.

قم بزراعة الخلايا العصبية NG108-15 في 10 مل من وسط زراعة الخلايا في قارورة T75 ، ثم احتضانها بعد ذلك عند 37 درجة مئوية في جو رطب. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ إلى 80٪ ، قم بتغيير الوسط بوسط دافئ وجديد.

بعد ذلك ، افصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق طرق الجزء السفلي من القارورة المتقاربة برفق. الطرد المركزي معلق الخلية لمدة خمس دقائق عند 600 جم وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط تمايز الخلايا الدافئة. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في صفيحة من 96 بئرا ، مع 200 ميكرولتر من وسط تمايز الخلايا.

احتضان العينة ليوم واحد عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أضف محلول القضبان النانوية الذهبي واحتضنه لمدة 24 ساعة إضافية. في هذا الإجراء ، قم بإقران الليزر بألياف ضوئية أحادية الوضع وقم بإنهائها بموصل FC. قم بقياس طاقة الليزر الناتجة باستخدام مقياس طاقة قياسي.

في اليوم 3 من حضانة القضبان النانوية ، قم بتثبيت موصل FC في البئر ، وقم بإشعاع العينة ، والتحكم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في موجة مستمرة بقوى ليزر مختلفة. في اليوم 5 ، قم بإزالة وسيط تمايز الخلايا من العينة وقم بإصلاحه بحجم 3.7٪ لكل حجم محلول فورمالديهايد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا بحجم 0.1٪ لكل حجم Triton X-100 لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 3٪ من الوزن لكل حجم BSA إلى العينة لمدة 60 دقيقة لمنع مواقع ربط البروتين غير المتفاعلة. قم بتسمية العينة بمضاد بيتا 3-توبولين طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة في الظلام ، مع جسم مضاد ثانوي مناسب. بعد ذلك ، قم بتسمية نوى الخلية باستخدام DAPI لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتصوير العينة باستخدام الفحص المجهري اللامع أو متحد البؤر ، باستخدام هدف 20x على الأقل. اختر مرشحات المجهر وفقا للجسم المضاد الثانوي ، وحدد مرشح DAPI لتصور نوى الخلية.