توليد مزارع الخلايا العقدية الشبكية الأولية من أجنة الزرد

ابدأ بأجنة الزرد في مرحلة النمو المبكرة في وسط الجنين.

قم بإزالة المشيمة ، الغشاء الواقي المحيط بالأجنة ، وانقل الأجنة إلى صفيحة مزرعة جديدة تحتوي على أوضاع.

قم بإزالة جزء الذيل من الجنين ، ثم افصل الرأس وافصل العينين برفق عن الرأس.

تحتوي العيون على شبكية العين ، وهي طبقة رقيقة من الأنسجة تحتوي على الخلايا العقدية الشبكية.

انقل العينين إلى أنبوب يحتوي على وسط زراعة خلايا الزرد.

قم بفصل العينين ميكانيكيا لتحرير الخلايا العقدية الشبكية وتشكيل معلق أحادي الخلية.

خذ أغطية موضوعة في صفيحة استزراع تحتوي على وسائط استزراع أسماك الزرد.

الغطاء مغلف ببوليمر اصطناعي وبروتين التصاق.

انقل الخلايا إلى وسط الغطاء واحتضنها.

ترتبط خلايا العقدة الشبكية بالأسطح المطلية ، علاوة على ذلك ، تطور هذه الخلايا نتوءات طويلة تسمى المحاور.

استرجع أجنة الزرد من الحاضنة ، واغمر الأجنة في طبق زراعة أنسجة بحجم 35 ملم يحتوي على 70٪ إيثانول ، لمدة 5 إلى 10 ثوان لتعقيمه. باستخدام ماصة النقل ، انقل الأجنة إلى طبق E2 Media # 1 الذي يحتوي على وسائط E2 معقمة لغسل الإيثانول الزائد. بعد ذلك ، انقل الأجنة إلى طبق E2 Media # 2 ، وقم بإزالة المشيمات باستخدام ملقط حاد. أخيرا ، انقل الأجنة إلى طبق E2 Media # 3 لإجراء التشريح.

باستخدام زوج من الملقط الناعم ، ضع الأجنة أمام صفار البيض واحتفظ بها بأحد الملقط ، وقم بإزالة الذيل الخلفي لكيس الصفار باستخدام الملقط الآخر. أمسك الرقبة بالملقط وانزع الرأس لتعريض الدماغ والعينين لوسائط E2. باستخدام طرف الملقط الناعم ، قم بلف العينين برفق من الرأس مع إمساك أنسجة الجمجمة لأسفل بالملقط الثاني. انقل أربع عيون إلى أحد الأنابيب المعدة مسبقا التي تحتوي على ZFCM +.

قم بتقطيع الماصة P20 برفق لأعلى ولأسفل حوالي 45 مرة لفصل الخلايا. انقل ZFCM + مع الخلايا المنفصلة إلى وسط الغطاء. حافظ على الثقافات على سطح الطاولة عند 22 درجة مئوية ، على رف رغوة البوليسترين لامتصاص الاهتزازات. في يوم التصوير ، افحص الخلايا تحت المجهر للتحقق من نمو محاور RGC.