تحضير ثقافات الشرائح العائمة الحرة من دماغ بشري بالغ

خذ أنسجة دماغية بشرية مغمورة في محلول تقطيع. يساعد الرقم الهيدروجيني البيولوجي والعناصر الغذائية للمحلول في الحفاظ على وظائف الأنسجة.

قم بإزالة طبقة السحايا الخارجية ، وقم بقص الأنسجة لإنشاء سطح مستو.

امسح المحلول الزائد من الأنسجة. قم بتوصيل الأنسجة المشذبة بقرص عينة بكتلة الاغاروز ، مع الحفاظ على الأنسجة على اتصال بالكتلة لسهولة التقسيم.

ضع القرص في صينية عازلة اهتزازية وقم بتغطية المنديل بمحلول تقطيع مثلج.

باستخدام الاهتزاز ، قم بإنشاء شرائح موحدة تحافظ على بنية الأنسجة.

تقليم الأنسجة الزائدة ، مما يضمن نسبة ثابتة من المادة الرمادية والبيضاء.

ضع الشرائح في طبق متعدد الآبار يحتوي على وسط ثقافة واحتضنها.

تظل الشرائح معلقة في الوسط لضمان وصول متساو إلى العناصر الغذائية ، وهي تقنية تعرف باسم ثقافة الشرائح العائمة الحرة.

تجديد الثقافة بانتظام بوسيط مكمل بعامل النمو العصبي للحفاظ على بقاء الأنسجة.

انقل العينة إلى طبق بتري يحتوي على محلول تقطيع. باستخدام أدوات جراحية دقيقة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السحايا المتبقية بعناية. اختر أفضل اتجاه للعينة لإنتاج شرائح ذات خصائص خاصة للتصميم التجريبي ، واستخدم شفرة مشرط رقم 24 لتقليم سطح مستو ليكون القاعدة التي سيتم لصقها على قرص العينة.

باستخدام ملعقة بلاستيكية يمكن التخلص منها وفرش طلاء دقيقة ، اجمع الجزء من طبق بتري ، وجفف المحلول الزائد بورق الترشيح. بعد ذلك ، استخدم الغراء الفائق لربط الأنسجة بطبق عينة الاهتزاز حتى يلتصق بإحكام بالطبق ويتلامس مع كتلة الاغاروز.

ضع قرص عينة الاهتزاز في الدرج المؤقت للاهتزاز. أغلق حامل السكين في مكانه مع تثبيت شفرة الحلاقة بإحكام. أضف محلول التقطيع وتأكد من أنه يغطي كل من العينة والشفرة. ثم ابدأ في تقطيع العينة إلى شرائح بحجم 200 ميكرومتر.

انقل الشرائح من الدرج العازل إلى طبق بتري يحتوي على محلول تقطيع وقم بقص أي حواف فضفاضة ومادة بيضاء زائدة إلى نسبة حوالي 70٪ قشرة و 30٪ مادة بيضاء. في خزانة التدفق الصفحي ، أضف 600 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا واحتضانها عند 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل طلاء الشرائح. بعد ذلك ، استخدم فرشاة الرسم لوضع شريحة واحدة في كل بئر.

إذا كان هناك أي آبار غير مستخدمة في اللوحة ، فاملأها ب 400 ميكرولتر من الماء المعقم. احتضان عند 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استكمل 10 ملليلتر من وسط الاستزراع المعد مسبقا بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ بتركيز 50 نانوغرام لكل ملليلتر.

بعد 8 إلى 16 ساعة ، قم بإزالة 333 ميكرولترا من الوسط المكيف من كل بئر وأضف 133 ميكرولترا من الوسط الطازج المكمل ب BDNF. استبدل ثلث الوسط المكيف بوسيط طازج مكمل BDNF كل 24 ساعة.