عزل واستزراع الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة الفئران باستخدام وسائط خالية من المصل

خذ دماغ الفئران المنغمر. افرمه إلى أجزاء صغيرة.

تجانس الأنسجة في مخزن مؤقت لتحرير الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة.

بمجرد أن يستقر النسيج غير المهضوم ، اجمع الخلايا التي تحتوي على المادة الطافية وأضف عازلة لفصل المايلين.

امزج المحتويات وأجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا عن المايلين والحطام. قم بإزالة طبقة حطام المايلين والمادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت والماصة لفصل الكتل.

مرر التعليق عبر مصفاة لإزالة مجاميع الخلايا المتبقية.

انقل الخلايا المفلترة إلى لوحة مزرعة مغطاة بأجسام مضادة وحيدة النسيلة خاصة بالخلايا الدبقية الصغيرة. احتضان لتسهيل التصاق الخلايا الدبقية الصغيرة.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الخلايا غير الملتصقة. أضف التربسين واحتضنه لتفكيك الخلايا الدبقية الصغيرة.

إزالة التربسين.

أضف وسائط خالية من المصل. احتضان على الجليد لإضعاف تفاعلات الخلايا والركيزة.

ماصة وجمع التعليق في أنبوب. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا الدبقية الصغيرة في وسائط خالية من المصل وانقلها إلى صفيحة متعددة الآبار مطلية بالكولاجين. احتضان لتسهيل التصاق الخلايا الدبقية الصغيرة.

أضف وسائط تحتوي على عوامل النمو والدهون. احتضان لنضج الخلايا الدبقية الصغيرة.

بعد جمع الأدمغة في DPBS بارد ، قم بتقطيع كل دماغ إلى قطع بحجم مكعب واحد ملليمتر في طبق بتري على الجليد بشفرة مشرط بارد ، ثم انقله إلى الخالط المثلج البارد مع 5 إلى 7 ملليلتر من المخزن المؤقت المثلج. بعد ذلك ، استخدم الخالط Dounce الفضفاض لفصل الأنسجة ب 10 إلى 20 ضربة لطيفة وغير مكتملة. احرص على عدم سحق الأنسجة الموجودة في الجزء السفلي من الخالط مباشرة. بدلا من ذلك ، ادفع الأنسجة عبر الفراغ بين جانبي المكبس والمجانس.

من المهم تجانس الأنسجة ببطء بجولات متعددة من الحفر للحفاظ على صلاحية الخلايا الدبقية الصغيرة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المكبس بعناية لمنع إدخال فقاعات الهواء. اسمح لقطع الأنسجة المنفصلة بشكل سيئ بالاستقرار في الجزء السفلي من الخالط ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد مبرد سعة 50 ملليلترا. بعد ذلك ، استبدل الحجم الذي تمت إزالته بمخزن مؤقت جديد ، وكرر إجراء التفكك لمدة ثلاث إلى أربع جولات ، أو حتى يتم فصل جميع الأنسجة.

في هذا الإجراء ، أضف المخزن المؤقت البارد إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر الذي يحتوي على تعليق الخلية ، واضبط الحجم الإجمالي إلى 33.5 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف 10 مل من MSB إلى تعليق الخلية ، واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. سينتج عن ذلك تركيز نهائي بنسبة 23٪ من MSB بحجم 43.5 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 15 دقيقة عند 500 جم عند 4 درجات مئوية مع الكبح البطيء. ثم قم بإزالة الطبقة العليا من المايلين والحطام والطافية باستخدام ماصة. توخ الحذر عند إزالة الطبقة العليا لضمان إزالة أكبر قدر ممكن منها.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من المخزن المؤقت للتحريك. قم بتقطيع معلق الخلية برفق ، لتفكيك أي كتل متبقية من الخلايا. في هذه الخطوة ، قم بتمرير تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الحطام الكبير أو كتل الخلايا. اشطف طبق الدهن المطلي ب OX42 ثلاث مرات باستخدام DPBS. لا تدع الطبق يجف تماما بين الغسل.

اسكب آخر غسول DPBS وقم بتطبيق تعليق الخلية المفلترة على طبق التحني. قم بتدوير اللوحة برفق لتوزيع الخلايا. بعد ذلك ، احتضن اللوحة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق. لا تحتضن لمدة تزيد عن 20 دقيقة ، وإلا سيصبح من الصعب جدا استعادة الخلايا من الطبق. بعد ذلك ، اشطف طبق المقلاة باستخدام DPBS 10 مرات لإزالة الخلايا غير الملتصقة.

سيتم ربط الخلايا الدبقية الصغيرة بإحكام باللوحة ، لذا قم بتدوير اللوحة مع كل شطف لضمان إزالة الخلايا الأخرى غير الملتصقة. اسكب آخر غسول DPBS ، واستبدله ب 15 مل من DPBS و 200 ميكرولتر من التربسين.

لتربسين الخلايا ، احتضن الطبق لمدة تقل عن أو يساوي 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق من التربسين ، ستظل الخلايا الدبقية الصغيرة عالقة على اللوحة. يسكب المزيج ويغسل الطبق برفق مرتين باستخدام DPBS لإزالة التربسين. ثم استبدلها ب 12 مل من MGM المثلج.

بعد ذلك ، ضع طبق المقلاة على الجليد لمدة دقيقتين للمساعدة في إضعاف تفاعل الخلية والركيزة ، وتأكد من أن الطبق مسطح لمنع مناطق طبق التحريك من الجفاف. بعد ذلك ، قم بعمل ماصة بقوة باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ووحدة تحكم ماصة بسرعة عالية لاستعادة الخلايا من طبق التحريك. ارسم شبكة 16 × 16 مع تيار السائل من الماصة لمحاولة إزالة جميع الخلايا.

من المهم إيجاد توازن بين الانتعاش العام للخلايا وصحة ثقافتك. سيؤدي سحب العينة المتكرر للمادة الطافية للخلية على طبق التحريك إلى تقليل قابلية مزرعتك للبقاء.

افحص الخلايا تحت المجهر بتكبير 20 ضعفا للتأكد من انفصالها عن اللوحة. ضع علامة على البقع الموجودة أعلى الطبق حيث تكون الخلايا عالقة وكرر سحب العينات في تلك المناطق. اجمع معلق الخلية وتناول 3 إلى 4 ملليلتر من المادة الطافية في كل أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بتدويرها لمدة 15 دقيقة عند 500 جم عند 4 درجات مئوية مع الكبح البطيء.

بعد 15 دقيقة ، قم بشفط المادة الطافية ، تاركا 0.5 مل من MGM مع حبيبات الخلية. ثم, أعد تعليق كل حبيبات في MGM المتبقية وتجميع الخلايا من جميع الأنابيب. بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.

الآن ، قم بتغطية 15 ميكرولترا من طلاء الكولاجين الرابع مباشرة في وسط صفيحة زراعة الأنسجة الأنيونية المطلية بالكاتيوني المكونة من 24 بئرا ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، قم بتخفيفها إلى 2.3 × ^10-5 لكل مليلتر في MGM. قم بشفط بقعة الكولاجين الوريدي ، وقم على الفور بوضع 15 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى هذه البقعة لإنتاج 3.5 × 10³ خلايا لكل بقعة.

بعد ذلك ، احتضن لمدة خمس إلى عشر دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق. ثم أضف برفق 500 ميكرولتر من ثاني أكسيد الكربون المتوازن ب₂ TIC إلى البئر.