عزل واستزراع الخلايا الجذعية العصبية البالغة من منطقة الفأر تحت الثفني

ابدأ بدماغ فأر على مصفوفة دماغية مبردة.

الحصول على الأقسام التي تحتوي على المنطقة تحت الكالوسال أو SCZ. انقل القسم إلى مخزن مؤقت للفوسفات البارد.

تحت مجهر تشريح ، قم بقص جزء SCZ.

يقطع SCZ المفصل إلى قطع أصغر.

انقل هذه القطع إلى عازلة للهضم. احتضان لفصل الخلايا عن الأنسجة.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط مناسب.

انقل الخلايا إلى لوحة مزرعة وأضف عوامل نمو محددة.

تنقسم الخلايا الجذعية العصبية البالغة ، وتشكل مجموعات تسمى المجالات العصبية.

يحد التوزيع غير السليم للمغذيات في مجموعات الخلايا من نمو الخلايا.

لتفريق العناقيد ، قم بأجهزة الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية. قم بإعادة تعليق المجموعات في مخزن مؤقت للتفكك واحتضانه.

قم بعرض المحلول لأعلى ولأسفل لتوليد خلايا مفردة.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

قم بتعليق الخلايا ونقلها إلى وسط مناسب للحصول على طبقة أحادية.

بمجرد تشريحها ، انقل دماغ الفأر إلى مخزن PBS البارد ، واشطفه مرتين لإزالة الدم الزائد. بعد ذلك ، ضع الدماغ في مصفوفة الدماغ على الجليد ، وقم بعمل قطع إكلية للحصول على شرائح بسمك ملليمتر واحد. بعد ذلك ، انقل شرائح الدماغ الخلفية التي تحتوي على مناطق SCZ إلى PBS الباردة.

تحت مجهر تشريح بتكبير منخفض ، قم بتشريح SCZ من منطقة المادة البيضاء في القشرة والحصين بإبرة مثنية بمقياس 30. بعد ذلك ، قم بإزالة مناطق القشرة فوق SCZ ، وضع SCZ المقطعة في PBS بارد في طبق بتري 35 ملم على الجليد.

يمكن تشريح منطقة المنطقة تحت الثفني بدقة من الأنسجة بأكملها باستخدام مصفوفة الدماغ وإبرة مثنية قياس 30.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS ، ثم قم بتقطيع الأنسجة المقطعة على الفور إلى قطع صغيرة. أعد تعليقها بملليلتر واحد من عازلة الهضم. بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ملليلترين من عازلة الهضم. ثم احتضنها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.

في هذه الخطوة ، اضغط على الأنبوب برفق لفصل الأنسجة المهضومة ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 145 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الأنسجة المهضومة بمليلتر واحد من التسخين المسبق واثنين من الوسط لغسل المخزن المؤقت للهضم ، وقم بسحب محلول العينة برفق خمس مرات كحد أقصى.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 145 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من وسط N2. ضع ملليلترا واحدا من وسط N2 في صفيحة غير مطلية بستة آبار ، وأضف ملليلترا واحدا من الخلايا العالقة لعمل حجم نهائي من ملليلتر.

بعد ذلك ، أضف 20 نانوغراما لكل مليلتر من EGF و 20 نانوغراما لكل مليلتر bFGF في كل بئر. رج طبق الثقافة المكون من ستة آبار برفق يدويا لخلط عوامل النمو المضافة مع الخلايا المطلية. بعد ذلك ، احتفظ بالصفيحة المكونة من ستة آبار في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

أضف 20 نانوغرام لكل مليلتر EGF و 20 نانوغرام لكل مليلتر bFGF لكل بئر كل يوم لمدة ثمانية أيام. كل يوم ثالث ، أضف 200 ميكرولتر من وسائط N2 للحفاظ على ما يقرب من ملليلترين من الوسط. هذه صورة للمجالات العصبية بعد ثمانية أيام.

في هذا الإجراء ، اجمع المجالات العصبية ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملم. الطرد المركزي الأنبوب عند 145 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق المجالات العصبية ب 0.5 مل من المخزن المؤقت للتفكك. احتضنها ب 0.5 مل من المخزن المؤقت للتفكك لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية لفصل المجالات العصبية إلى خلايا مفردة.

قم بعمل ماصة محلول العينة برفق لأعلى ولأسفل أقل من خمس مرات، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 145 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق المجالات العصبية بملليلتر واحد من وسط N2. بعد طلاء صفيحة من ستة آبار بلامينين PLL ، قم بطلاء الخلايا عند 2.5 × 10⁵ خلايا لكل مليلتر مع ملليلترين من N2 وسط لكل بئر. الحفاظ على الخلايا الجذعية العصبية البالغة SCZ مع العلاج اليومي لعوامل النمو لمدة خمسة أيام قبل مرورها.