عزل الخلايا المناعية المتسللة للورم من دماغ الفئران

خذ دماغ فأر منفوخ يحتوي على ورم.

تزيل خطوة التروية الخلايا المناعية المنتشرة ولكنها تحتفظ بالخلايا المتسللة إلى الورم.

عزل الأنسجة التي تحتوي على الورم.

الآن ، قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا.

تعمل القوة الميكانيكية على إرخاء الأنسجة وتطلق الخلايا.

نقل الأنسجة المنفصلة إلى أنبوب.

جهاز طرد مركزي وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الحطام.

أعد تعليق الأنسجة في محلول هضم يحتوي على الكولاجيناز و DNase.

يحط الكولاجيناز المصفوفة خارج الخلية ، ويطلق الخلايا. يتحلل DNase من الحمض النووي الملوث

أضف مخزن مؤقت لإيقاف النشاط الأنزيمي.

قم بتصفية التعليق لإزالة مجاميع الخلايا والحصول على تعليق أحادي الخلية.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في وسط متدرج عالي الكثافة. الآن ، تراكب بوسط تدرج منخفض الكثافة ، لتشكيل تدرج فصل بواجهة واضحة.

جهاز طرد مركزي لفصل الطبقات. تتجمع الخلايا المناعية عند الواجهة بين الوسائط المتدرجة بينما يطفو حطام الخلية فوقها.

اجمع الخلايا المناعية لمزيد من التحليل.

في هذا الإجراء ، باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ذات حافة واحدة ، قم بعزل منطقة الدماغ التي تحتوي على الورم عن طريق عمل قطع سهمي لمركز الدماغ لتقسيم نصفي الكرة الأرضية. اقلب الجانب الإنسي لنصف الكرة الأرضية المماثل لأسفل ، وقم بعمل قطع إكليلي واحد في المخيخ ، وقطع آخر في البصلة الشمية لعزل الأنسجة المستهدفة التي تحتوي على غرسة الورم.

بعد ذلك ، ضع الأنسجة المستهدفة في مطحنة الأنسجة الزجاجية المسماة ، والتي تحتوي على 1 مليلتر من DPBS. ادفع المكبس لأسفل ، ولفه سبع مرات لتعطيل الأنسجة. بعد ذلك ، ارفع المكبس للسماح للسائل بالاستقرار مرة أخرى في قاع طاحونة الأنسجة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ومع ذلك ، قم بلف المكبس أربع مرات فقط خلال التكرارين التاليين وثلاث مرات خلال التكرار الأخير لتجنب الإفراط في إفراط أنسجة المخ.

بعد ذلك ، ضع ثلاثة أحجام سعة 1 مليلتر من DPBS المثلج على جوانب المكبس لشطف مادة الدماغ المتبقية في طاحونة الأنسجة. بعد ذلك ، أعد تعليق مادة الدماغ الثلاثية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر على الجليد. اشطف جوانب مطحنة المناديل DAPS بكمية إضافية من DPBS المثلج وأضفها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.

احتفظ بجميع الأنابيب التي تحتوي على مادة دماغية مثلث على الجليد ، حتى تتم معالجة جميع العينات. بعد ذلك ، قم بتدوير مادة الدماغ الثلاثية في أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر عند 740 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق مادة الدماغ المحببة في 1 مليلتر من خليط معد مسبقا من الكولاجيناز وإنزيمات الجهاز الهضمي DNase I.

ضع أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر في رف أنبوب الاختبار ، وضع الرف في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم حرك العينات برفق مرتين طوال فترة الحضانة عن طريق النقر على الأنابيب لتسهيل تفكيك الأنسجة.

بعد ذلك ، أضف 6 مل من DPBS المثلج إلى كل أنبوب لتخفيف الإنزيمات الهاضمة. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة التعليق ، وتصفية الحجم الكلي من خلال مرشحات شبكية معقمة من النايلون سعة 70 ميكرون إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 15 مليلتر على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتدوير تعليق خلايا الدماغ لأسفل عند 740 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتحقيق حبيبات أحادية الخلية. قم بإزالة الأنابيب سعة 15 مليلتر من جهاز الطرد المركزي وضعها على الجليد. بعد ذلك ، قم بزيادة إعداد درجة الحرارة على جهاز الطرد المركزي إلى حوالي 21 درجة مئوية استعدادا للخطوة التالية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية بالكامل وأعد تعليق كريات الخلية في البداية في 1 مليلتر من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ ، باستخدام ماصة دقيقة P1000. ثم أضف أربعة ملليلتر إضافي من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ إلى كل أنبوب. ضع الأغطية بإحكام وقم بتجانس تعليق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق عدة مرات.

بعد ذلك ، قم بنقل أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر ، التي تحتوي على خلايا دماغية معلقة في وسائط طرد مركزي بكثافة 70٪ من الجليد إلى أنبوب اختبار في درجة حرارة الغرفة. واحدا تلو الآخر ، قم بتراكب 2 مل من محلول وسائط الطرد المركزي بكثافة 37٪ بعناية على 5 ملليلتر من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ لتشكيل واجهة نظيفة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة.

بعد ذلك ، ضع علامة على موضع الواجهة بين الطبقتين بعلامة ذات رأس دقيق بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة بعد الطرد المركزي عندما يصبح التمييز أقل وضوحا. قم بتدوير أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر عند 740 مرة جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع لتجنب تعطيل الواجهة بين طبقات وسائط الطرد المركزي الكثافة.

بعد ذلك ، قم بتجميع PBMCs التي تراكمت في الواجهة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة عن طريق إدخال ماصة دقيقة P200 في الأنبوب ، متجاوزة طبقة الدهون بعناية. بمجرد وصولك إلى مستوى نطاق PBMC ، استخرج ببطء 200 ميكرولتر من سطح طبقة وسائط الطرد المركزي ذات الكثافة 70٪ وقم بنقله إلى أنبوب البولي بروبلين FACS المسمى على الجليد على التوالي. كرر هذه الخطوة مرة واحدة لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 400 ميكرولتر لكل عينة.