إنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الفئران

خذ صفيحة دقيقة مع ثقافة ملتصقة للخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الفئران. تحتوي الثقافة على الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن.

قم بإزالة الوسط ، واحتضانه بمحلول إنزيم لفصل الخلايا ، ثم انقلها إلى أنبوب.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية بالحطام الخلوي. أعد تعليق الخلايا في وسط دافئ.

قم بعمل ثلاثية باستخدام حقنة لتفتيت كتل الخلايا والتصفية باستخدام مصفاة للحصول على تعليق أحادي الخلية.

أضف بوليمر حيوي قابل للربط الضوئي ، وعوامل تشابك ، ومكونات مصفوفة خارج الخلية.

يسكب المزيج في قالب متصل بغطاء. قم بتعريض الخليط لضوء عالي الكثافة للحث على التشابك ، وتشكيل هلام وتغليف الخلايا الدبقية.

قم بإزالة القالب وضع الغطاء في صفيحة دقيقة. أضف وسيطا دافئا واحتضن الجل في ظل الظروف الفسيولوجية.

تتكاثر الخلايا داخل المصفوفة الداعمة خارج الخلية وإنشاء شبكة خلوية ، مما يؤدي إلى إنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الدبقية.

قبل 24 ساعة من تغليف الخلية ، استنشق الوسط من الثقافات الأولية لمدة أسبوعين ، وأضف 1 مليلتر من الوسط الطازج إلى كل بئر. في يوم تغليف الخلايا ، قم بإعداد 12.5 مل من التربسين المخفف و 25 مل من الوسط لكل طبق مكون من 12 بئرا ، وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 مليلتر لإضافة حوالي 1 مليلتر من التربسين المخفف إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا.

احتضن لمدة 20 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تنفصل طبقة الخلية المتقاربة عن اللوحة. بعد الحضانة ، استخدم ماصة سعة 1 مليلتر لاستعادة الخلايا المنفصلة ، والتي يجب أن تظهر كقطعة عائمة واحدة ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلترا. خفف بحجم مكافئ من المتوسط والطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسط الدافئ. قم بثلاثية الخلايا خمس مرات باستخدام الماصة ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 مرة جم لمدة دقيقتين. بعد الدوران ، قم بصب المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 ملليلتر من الوسط الدافئ ، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلترا.

بعد ذلك ، باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 18 ، قم بترتيورث محلول الخلية ثلاث مرات وقم بتصفية التعليق من خلال غربال خلية 40 ميكرون في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد. بعد ذلك ، اجمع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وقم بتخفيف 1 إلى 100 في وسط دافئ ، واحسب الخلايا بعداد خلية آلي.

احتضان الخلايا المتبقية في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى خطوة التغليف. دافئ 12.5 مل من الوسط الساذج و 12.5 مل من الوسط المكيف لكل نبات 12 بئر من الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد. ثم ، قم بوزن 7 ملليغرام من HAMA لكل صفيحة نبتة مكونة من 12 بئرا ، وأضفها إلى معقمة مفلترة لتركيز 2٪ من الوزن للحجم. قم بتقطيع المحلول لمدة 60 دقيقة عند 20 كيلو هرتز حتى يذوب HAMA تماما.

أثناء الصوتنة ، قم بإعداد حلول فردية بنسبة 10٪ من كل من TEA و NVP. قم أيضا بإعداد محلول 1 ملليمولار من اليوزين في 1 مليلتر من PBS المعقم. بعد ذلك ، لكل طبق مكون من 12 بئرا ، اصنع خليطا نهائيا 1.4 1.4 ملليلتر من 1 × 10⁷ خلايا ، 0.5٪ HAMA ، 20٪ خليط صفيحة قاعدية في PBS ، 0.1٪ شاي ، 0.1٪ NVP ، و 0.01 مللي مولار يوزين Y.

بعد خلط المحلول برفق، استخدم ماصة مزودة برأس سعة 1 مليلتر لتوزيع 100 ميكرولتر في كل قالب PDMS. بعد ذلك ، قم بتعريض العينات لضوء LED أخضر عالي الكثافة في صندوق مغلق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

يعد تعريض LED الأخضر لمدة خمس دقائق ضروريا لتشكيل هلام 3D. سيصبح اللون الأحمر الذي أدخله اليوزين Y شفافا ويشير إلى إنهاء التفاعل.

بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من الوسائط الدافئة والمكيفة إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا ؛ أمسك كل غطاء بين الإبهام والسبابة واستخدم ملاقط منحنية لتقشير قالب PDMS ببطء دون إزاحة الجل. ضع القالب في بئر بوسط مكيف.

إزالة القالب هي الخطوة الأكثر صعوبة. يجب أن يتم ذلك بعناية فائقة لمنع إزاحة الجل وكسر الغطاء. قد يستغرق هذا ممارسة.

بعد نقل جميع القوالب إلى آبار اللوحة ، أضف 1 ملليلتر إضافي من وسط DMEM / F12 الدافئ إلى كل بئر. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين قبل التصوير.