عزل الخلايا العصبية DRG والزراعة المشتركة مع سلائف خلايا شوان لتوليد خلايا شوان

خذ الحبل الشوكي لجنين الفئران مع عقدات الجذر الظهرية المرفقة ، أو DRGs ، التي تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

افصل DRGs الفردية عن الحبل ، وانقلها إلى أنبوب ، وجهاز طرد مركزي ، وتخلص من أي بقايا أنسجة.

أضف الإنزيمات لفصل الخلايا العصبية DRG والخلايا الدبقية.

قم بتدوير الخلايا وإزالة أي حطام. أضف وسيطا لصيانة الخلايا العصبية وثلاثي الأبعاد لتوليد معلق أحادي الخلية.

انقل المعلق إلى صفيحة دقيقة مطلية بركيزة ثقافة ، مما يعزز التصاق الخلية.

إدخال وسيط تنقية واحتضانه. تقضي العوامل المثبطة للوسط على الخلايا الدبقية المنقسمة بينما تعيش الخلايا العصبية غير المنقسمة.

خذ الخلايا الشبيهة بخلايا شوان ، أو SCLCs ، في وسط زراعة مشتركة. تتفاعل SCLCs ، مقدمة خلايا شوان ، مع الخلايا العصبية الطرفية الجنينية.

أدخل التعليق على الخلايا العصبية DRG واحتضانه. يعزز تفاعل SCLCs مع الخلايا العصبية DRG نضجها في خلايا شوان.

خلايا Schwann التي تم إنشاؤها جاهزة للتحليل.

لحصاد العقد الجذرية الظهرية ، انقل الجنين الأول إلى طبق مزرعة بطول 10 سم يحتوي على PBS بدرجة حرارة الغرفة تحت مجهر تشريح في وضع الانبطاح وأدخل ملقطا دقيقا على طول جانبي الحبل الشوكي.

باستخدام التشريح الحاد ، افصل الحبل الشوكي عن الأنسجة الرخوة المحيطة ، باستخدام ملقط لاستئصال الحبل الشوكي على طول فتحة الرقبة وكعب الذيل. قم بإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية من الحبل الشوكي المحرر حتى يبقى فقط الحبل الشوكي وجذور الأعصاب والعقدة الجذرية الظهرية المرفقة.

افصل العقد الجذرية الظهرية الفردية عن جذورها العصبية المتصلة. بعد ذلك، استخدم قلم ماصة مزود برأس ماصة سعة 1 مليلتر لنقل ما يصل إلى 100 عقد جذرية ظهرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر من PBS.

اجمع العقد عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف لكل أنبوب. بعد 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للعقد الجذرية الظهرية مرة أخرى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لترثيل الكريات برفق في وسط صيانة الخلايا العصبية بعد العقدة الجذرية الظهرية.

قم بزرع خلايا العقدة الجذرية الظهرية عند 5 × 10³ خلايا لكل سنتيمتر مربع على ألواح ستة آبار مطلية ب Poly-D-Lysine laminin في 1.5 مل من وسط صيانة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية لكل بئر.

بعد يومين في الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، اغسل الخلايا وأعد مزارع الخلايا العصبية إلى الحاضنة في وسط تنقية الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية الطازجة لمدة يومين آخرين.

بعد 3 إلى 4 دورات صيانة وتنقية ، يجب أن تكون مزارع الخلايا العقدية الجذرية الظهرية إيجابية للعلامة العصبية Tuj-1 وسلبية لعلامة الخلايا الدبقية S100 beta.

في اليوم السابع من مزرعة الخلايا الشبيهة بخلية شوان ، اشطف الخلايا في PBS ، متبوعا بالتفكك باستخدام 0.5 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمي المؤتلف لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الزراعة المشتركة وزرع الخلايا الشبيهة بخلايا شوان على ثقافة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية المنقاة عند 1 × 10³ خلايا لكل سنتيمتر مربع لمدة 14 يوما من الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.