$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ابدأ بلوحة ثقافة كبيرة تحتوي على خلايا عصبية متمايزة مشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات مع شبكة عصبية كثيفة.
احتضان هذه الخلايا العصبية بإنزيمات محللة للبروتين خفيفة لفصلها عن اللوحة ، ورفعها على شكل ورقة.
مع استمرار الحضانة ، تعطل الإنزيمات جزئيا اتصالات الخلايا ، مما يؤدي إلى إرخاء الشبكات العصبية.
أضف وسيطا مزرعيا لإيقاف نشاط الإنزيم.
قم بتقطيع الخلايا العصبية المنفصلة بشكل متكرر لفصلها عن بعضها البعض.
قم بتصفية الخلايا العصبية من خلال مصفاة خلوية لإزالة كتل الخلايا وجمع الخلايا العصبية الفردية.
جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. أعد تعليقها في وسط النمو.
لإعادة الطلاء ، قم بزرع هذه الخلايا العصبية على بوليمر ولوحة متعددة الآبار مطلية بالبروتين اللاصق. احتضان للسماح بارتباطهم.
تستخدم
الخلايا العصبية العناصر الغذائية من الوسط لتظل قابلة للحياة. استبدل وسط المزرعة بانتظام للحفاظ على مستويات العناصر الغذائية.
احتضان أكثر للسماح بنضوج الخلايا العصبية وتشكيل الروابط بينهما.
ابدأ بشطف لوحة الخلايا العصبية المتمايزة برفق باستخدام PBS. قم بتفريق PBS أسفل جدار اللوحة ، وليس مباشرة على الخلايا لتجنب تعطيلها. استنشق PBS من حافة الطبق أثناء قلبه ، مع الحرص على عدم لمس الخلايا.
ضع ما لا يقل عن 1 ملليلتر من الإنزيم المحلل للبروتين لكل صفيحة طولها 10 سنتيمترات ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 40 إلى 45 دقيقة. أثناء الحضانة ، افحص الخلايا العصبية على مجهر تباين الطور ، واستمر في علاج البروتياز حتى تنفصل الشبكة العصبية تماما عن اللوحة وتبدأ في التفكك. عندما تنفصل الخلايا العصبية ، توقف عن الهضم بإضافة 5 ملليلتر من وسائط DMEM الطازجة لكل 1 مليلتر من البروتياز.
استخدم ماصة مصلية لتقليب الخلايا برفق على اللوحة من 5 إلى 8 مرات ، مع التأكد من عدم الضغط الشديد. قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر قطرة قطرة ، واشطف المصفاة ب 5 ملليلتر إضافية من وسائط DMEM الطازجة.
استخدم جهاز طرد مركزي على الطاولة لتدوير الخلايا لأسفل عند 1,000 مرة جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أعد الأنبوب المخروطي إلى خزانة السلامة الحيوية وشفط معظم الوسائط ، مع ترك 250 ميكرولترا للحفاظ على رطوبة الخلايا. أعد تعليق الخلايا برفق في 2 ملليلتر من وسائط DMEM الطازجة ، وقم بتمريرها عبر نهاية ماصة مصلية سعة 5 ملليلتر.
أخيرا ، اقلب الأنبوب من 2 إلى ثلاث مرات. استخدم مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق لحساب الخلايا القابلة للحياة ، ثم قم بتخفيف الخلايا باستخدام DMEM الطازج إلى التركيز المطلوب. أضف المكملات الغذائية المناسبة إلى الأنبوب اعتمادا على متطلبات خط الخلية المحدد ، واخلط الخلايا برفق عن طريق إمالة الأنبوب المخروطي 2 إلى 3 مرات.
قم بشفط طلاء اللامينين من صفيحة مكونة من 24 بئرا واشطفه مرة واحدة باستخدام PBS. قم بشفط PBS وتطبيق محلول الخلية على كل بئر بحركة على شكل ثمانية لتجنب التكتل. عند الانتهاء من طلاء الخلايا ، أعد اللوحة إلى الحاضنة التي تم ضبطها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.