تقنية لتوليد الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

خذ الخلايا الجذعية الجنينية للفأر ، أو mESCs ، معلقة في وسط تمايز ، واحتضنها.

في ثقافة التعليق ، تتجمع mESCs لتشكيل بنية تسمى الأجسام الجنينية أو EBs.

EBs عبارة عن مجاميع ثلاثية الأبعاد تحاكي الجنين النامي ويمكن تمييزها إلى خلايا عصبية.

انقل EBs إلى أنبوب واتركها تستقر عن طريق الجاذبية.

قم بإزالة الوسط المستنفد من المغذيات ؛ أعد تعليق EBs في وسط طازج ، وانقلها إلى طبق ثقافة.

احتضان ثقافة التعليق لتسهيل نمو EBs.

انقل EBs المعلقة في الوسط إلى طبق متعدد الآبار. الآبار مغطاة ببروتين التصاق ، مما يسمح ل EBs بالالتصاق.

أدخل حمض الريتينويك ، الذي يدخل الخلايا ويؤدي إلى تكوين مركب نسخ.

يحفز المركب التعبير الجيني ، مما يعزز تمايز الخلايا إلى خلايا سلفة عصبية ، أو NPCs ، التي تظهر عمليات خلوية ممتدة.

أضف 1.5 مليون خلية جذعية جنينية للفأر إلى طبق بكتيري غير لاصق في 10 ملليلتر من وسط التمايز القاعدي ، واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بتكوين الجسم الجنيني.

بعد يومين ، انقل مجاميع الخلية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مليلتر ، واتركها تستقر عن طريق الجاذبية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من وسط التمايز القاعدي الطازج لإعادة تعليق الأجسام الجنينية. بعد ذلك ، أعد زرعها في طبق جديد غير لاصق واحتضنها لمدة يومين آخرين.

اجمع وبذر حوالي 50 جسما جنينيا في 2 مل من وسط التمايز القاعدي لكل بئر على صفيحة من ستة آبار مغطاة بالجيلاتين. لتحريض حمض الريتينويك ، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RHA في كل بئر إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومولار. أعد اللوحة إلى الحاضنة وقم بتمييز الخلايا لمدة أربعة أيام أخرى.