طريقة أنبوب الأسطوانة المعدلة للثقافة طويلة الأمد لشرائح دماغ القوارض

خذ شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من دماغ القوارض. تتكون الشرائح من الحصين الذي يحتوي على الخلايا العصبية في الحصين.

انقل شرائح الدماغ إلى أغطية تحتوي على بلازما الدجاج.

ضع البلازما الممزوجة بالثرومبين على الشرائح. يحفز الثرومبين تخثر البلازما ، مما يخلق سقالة بيولوجية تعزز التصاق الشرائح بالغطاء.

خذ أنابيب أسطوانية مسطحة الجوانب مع فتحة على الجانب المسطح وقرص لاصق متصل حول الفتحة الموجودة على السطح الخارجي للأنابيب.

ضع الغطاء على الأقراص اللاصقة ، مع التأكد من أن شرائح الدماغ تواجه الجزء الداخلي من الأنابيب.

أضف وسيطا للثقافة العصبية إلى الأنابيب وتتدفق في خليط ثاني أكسيد الكربون والهواء.

قم بتغطية الأنابيب ، وأدخلها في رف الأسطوانة ، واحتضنها بحركة متدحرجة.

تدعم

التهوية التي توفرها الحضانة المتدحرجة ومغذيات الوسط زراعة شرائح الدماغ على المدى الطويل.

للبدء ، قم بإعداد رف أنبوب الأسطوانة ، وقم بعمل رقصة للمساعدة في حفر ثقب في أنابيب الأسطوانة ، كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. باستخدام الرقصة ، أمسك في موضعه أنبوب ثقافة بلاستيكي مسطح الجوانب 1 سم بحيث يكون الجانب المسطح متجها لأعلى. بعد ذلك ، قم بحفر ثقب قطره 6 ملم مع مركزه 1 سم من الأسفل ومركزه بين جانبي الأنبوب.

باستخدام أداة إزالة الحواف الدوارة ، قم بتنعيم حواف الحفرة وقم بعمل أربعة أخاديد على الحافة الداخلية للفتحة لتسهيل تصريف الحفرة أثناء الدوران. بعد ذلك ، اشطف الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم جففها بالهواء في خزانة السلامة البيولوجية. قم بتعقيم الأنابيب في بعض أقراص مطاط السيليكون اللاصقة المثقوبة مقاس 12 ملم لمدة 40 دقيقة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

بعد 20 دقيقة ، أعد وضع الأنابيب والأقراص بحيث يتم تعقيم جميع الأسطح المكشوفة. بعد ذلك ، انزع الدعامة البيضاء من القرص اللاصق. قم بمحاذاة الثقوب وتثبيت مطاط السيليكون على الجزء الخارجي من الأنبوب.

بمجرد الحصول على الشرائح ، ضع 2 ميكرولتر من بلازما الدجاج في منتصف الجانب المحفور بالصور من الغطاء المعد. انشر البلازما قليلا للحصول على بقعة قطرها من 3 إلى 4 ملليمترات. بعد ذلك ، استخدم ملعقة معقمة ضيقة الرأس لرفع شريحة دماغية جاهزة. استخدم ملقطا مغلقا للحفاظ على الشريحة على طرف الملعقة أثناء رفع الشريحة. المس الملعقة ببقعة البلازما على الغطاء ، وباستخدام ملقط مغلق ، ادفع الشريحة على الغطاء.

أضف طبقة رقيقة من بلازما الكتاكيت على الغطاء قبل وضع الشريحة وكمية قليلة من البلازما المعالجة بالثرومبين لتغطية الشريحة. إذا طفت الشريحة ، فلن تظل ملتصقة عند إزالة الجلطة.

بعد ذلك ، امزج 2.5 ميكرولتر من البلازما و 2.5 ميكرولتر من الثرومبين في أنبوب منفصل. ضع بسرعة 2.5 ميكرولتر من هذا الخليط فوق الشريحة وحولها ، وقم بتقطيعها لأعلى ولأسفل برفق لخلطها. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف من الجانب المكشوف من لاصق مطاط السيليكون المثبت مسبقا على أنبوب الأسطوانة. بعد ذلك ، ضع الغطاء مع شريحة الدماغ على المادة اللاصقة ، وقم بمحاذاة الشريحة داخل الفتحة.

لضمان الالتصاق ، قم بتطبيق ضغط ناعم متساو على الغطاء بالإبهام عن طريق الضغط على الغطاء لأسفل بالتساوي والاحتفاظ به لمدة دقيقة واحدة تقريبا أثناء نقله إلى خزانة السلامة البيولوجية.

يجب أن يكون الضغط على الغطاء للالتصاق بالأنبوب دون تسرب مناسبا تماما ويتم الحفاظ عليه لفترة كافية للتخلص من قنوات الهواء في المادة المانعة للتسرب. الضغط الشديد سوف يكسر الغطاء.

في خزانة السلامة البيولوجية ، أضف 0.8 مل من وسط الثقافة العصبي القاعدي الكامل لكل أنبوب. بعد ذلك، قم بتدفق خليط هواء بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من خلال ماصة مراعي معقمة مسدودة بالقطن مثبتة بإحكام بواسطة مشبك. استخدم هذا لشطف أنبوب الأسطوانة بخليط الغاز وتغطية الأنبوب بسرعة أثناء سحبه من حول الماصة.

بعد ذلك ، قم بتسمية الأنابيب برقم الشريحة ورقم الرف. أدخل الأنابيب في رف الأسطوانة ، مع التأكد من أنها متوازنة هندسيا. إذا كان هناك عدد فردي من الأنابيب ، فأضف أنابيب فارغة لتحقيق التوازن.

ضع الرفوف في حاضنة أسطوانية 35 درجة مئوية مع بكرات تدير رف الأسطوانة للحفاظ على الوسط في قاع الأنابيب. قم بإمالة الحاضنة للخلف بمقدار 5 درجات تقريبا عن طريق رفع أمامها على لوحة.