بدء التمديد السريع للعصبية وتشكيلها الوصلات العصبية الوظيفية

ابدأ بتجميع جهاز ميكروفلويديك يحتوي على قنوات دقيقة داخل طبق مغطى باللايسين.

بذور الخلايا العصبية الجنينية ذات وسط النمو في الآبار الموائع الدقيقة ، مما يسمح لها بالتدفق عبر القنوات الدقيقة.

احتضان لتسهيل الارتباط العصبي ونموه ، وتشكيل مجموعات عصبية معزولة جسديا.

بتفكيك الإعداد وضع الطبق في غرفة مناور دقيق مع تدفق محلول ملحي للحفاظ على صلاحية الخلية.

إدخال الخرز المغلفة بالليسين بالقرب من الخلايا العصبية ، مما يمكن الخلايا العصبية أو إسقاطات الخلايا من إرفاق وتشكيل مجمعات الخرزة العصبية.

باستخدام معالج دقيق ، قم بتطبيق الشفط لإشراك مركب الخرز والعصبية من قناة واحدة.

اسحب هذا المركب للحث على التوتر الميكانيكي ، مما يؤدي إلى تمدد العصبة السريع.

قم بتوجيه هذا نحو مركب خلية عصبية آخر واحتفظ به باستخدام معالج دقيق ثان.

احتفظ بكلا الخرزتين في مكانهما لتسهيل تكوين اتصال عصبي.

حرر الشفط واستبدل المحلول الملحي بوسط ثقافة.

احتضان لإنشاء روابط وظيفية بين الخلايا العصبية ، وتعزيز التواصل من خلال الناقلات العصبية.

قم بإزالة الوسط من الآبار العلوية لأجهزة الموائع الدقيقة دون إفراغ الآبار. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الخلية المركز في البئر العلوي الأيمن لجهاز الموائع الدقيقة ، وتحقق في المجهر من كيفية تدفق الخلايا داخل جهاز الموائع الدقيقة أحادي السكان.

لصفيحة الخلايا في جهاز المجموعات السكانية المتعددة ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الخلية المركز في كل من الآبار العلوية. تحت المجهر ، تحقق مما إذا كانت الخلايا داخل الغرف. بعد ذلك ، ضع الأجهزة في الحاضنة لمدة 15 إلى 30 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية بالركيزة.

بعد أن تلتصق الخلايا بالركيزة ، أضف 40 ميكرولترا من NBM إلى البئرين العلويين لجهاز السكان الفردي. سيساعد ذلك في إزالة فقاعات الهواء من القنوات الدقيقة. أضف 20 ميكرولترا من NBM إلى الآبار العلوية لجهاز المجموعات السكانية المتعددة ، وهي نفس الآبار التي تم فيها حقن الخلايا. يجب أن تبرز الوسائط قليلا لتشكيل الغضروف المفصلي الإيجابي ، وإعطاء الآبار جانبا علويا من الكعك.

قبل يوم إلى يومين من إزالة الأجهزة الموائع الدقيقة ، أضف 2 مل من NBM الدافئ مسبقا إلى كل طبق عينة ، وغمر الغرف. ثم احتفظ بالأجهزة في الحاضنة. بعد ذلك ، استخدم ملاقط معقمة وطرف ماصة لإزالة أجهزة الموائع الدقيقة من الغطاء ، تاركا تكوينا منقوشا للخلايا العصبية.

في هذا الإجراء ، أضف 40 إلى 60 ميكرولترا من الخرز المطلي ب PDL المحضر إلى ثقافة الخلايا. بعد ذلك ، أعد العينة إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة لتعزيز تكوين جهات الاتصال المتشابكة. بعد ذلك ، قم بتثبيت العينة في إعداد تجريبي بحيث يمكن تقييم الخلايا من الأعلى بواسطة ماصتين دقيقتين والوصول إليها بصريا أيضا. في هذا التكوين ، توجد كاميرا CCD على المنفذ الجانبي للمجهر لالتقاط الصور. قم بتوصيل كل ماصة مملوءة بالمحلول الملحي بحقنة سعة 1 ملليلتر. ثم قم بتنقية العينة بمحلول ملحي فسيولوجي.

بعد ذلك ، تحت المجهر ، تحقق من الفجوة بين مجموعتين عصبيتين معزولين للتأكد من أن المجموعتين غير متصلتين بشكل طبيعي. حدد حبة PDL غير متصلة بالخلايا العصبية في مجال الرؤية. قم بمحاذاة الخرزة بطرف ماصة دقيقة من خلال التركيز على الخرزة ثم على الماصة الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بإنزال الطرف بالقرب من الخرزة قدر الإمكان عن طريق مراقبتها من خلال المجهر. بعد ذلك ، قم بالضغط السلبي على الماصة لالتقاط الخرزة ، والحفاظ على الضغط السلبي طوال التجربة.

الآن ، حدد حبة PDL متصلة بخلية عصبية في مجال الرؤية ، وقم بتوصيلها بالماصة الدقيقة الثانية باستخدام الشفط. اسحب مركب الخلايا العصبية الخرزية PDL عن طريق تحريك المعالج الدقيق أو مرحلة العينة ببطء بسرعة 0.5 ميكرومتر في الدقيقة لمدة 1 ميكرومتر ، وتوقف مؤقتا لمدة خمس دقائق للسماح ببدء العصب.

اسحب مركب الخلايا العصبية PDL عن طريق تحريكه ببطء بشكل جانبي بسرعة 0.5 ميكرومتر في الدقيقة على 2 ميكرومتر. ثم توقف لمدة خمس دقائق للسماح باستطالة العصب. بعد البدء الناجح وتمديد العصبية لأول 5 ميكرومتر ، اسحب النيوريت باستمرار بسرعة 20 ميكرومتر في الدقيقة.

لتوصيل الخلايا العصبية ، حدد منطقة غنية بالعصبيات. استخدم حبات أخرى لقياس ارتفاع طرف الماصة فوق زلة الغطاء ، وخفض مركب PDL العصبية الخرزة بحيث يتصل جسديا بالخلايا العصبية. اترك مركب PDL العصبي العصبي على اتصال مع العصبة المستهدفة أثناء التلاعب بالماصة الدقيقة الثانية. بعد ذلك ، قم بخفض الماصة الثانية مع حبة PDL الثانية فوق العصبة المشكلة حديثا على بعد حوالي 20 ميكرومتر من الخرزة الأولى ، واستخدم حبة PDL الثانية لدفع خيوط العصبية الجديدة نحو الخلية المستهدفة.

بعد ذلك ، أمسك كلتا الخرزتين في مكانهما لمدة ساعة واحدة على الأقل. تحقق من عدم وجود تورم بؤري ، سماكة الخلايا العصبية التي تلامس الخرزة بالمجهر. خلال هذا الوقت ، قم بتغيير وسط العينة ببطء من محلول ملحي فسيولوجي إلى NBM متوازن بثاني أكسيد الكربون المسخن مسبقا.

حرر الخرزة من الماصة الثانية عن طريق تحرير الشفط. إذا ظل العصب الجديد متصلا ، فحرر السرعة الأولى أيضا. بعد ذلك ، ضع العينة بعناية مرة أخرى في الحاضنة لتقوية الاتصال العصبي للتجارب المستقبلية.