JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 4:13 د • July 8th, 2025
خذ أنسجة الورم الأرومي الدبقي البشري، وهو ورم دماغي أساسي ينشأ من الخلايا الدبقية.
اغسل المنديل باستخدام وسيط معالجة مثلج لإزالة الدم المتبقي.
نقطع الأنسجة إلى قطع وندخلها في قالب تضمين يحتوي على الاغاروز المصهور.
قم بتبريد القالب ، مما يسمح للأغروز بالبلمرة وتشكيل مصفوفة هلامية مستقرة.
قم بإزالة كتلة الأنسجة من القالب وثبتها على لوحة عينة الاهتزاز.
أضف وسيط المعالجة المثلج البارد لغمر الكتلة. مرر خليط غاز مؤكسج لتهوية الوسط ، مما يحافظ على صلاحية الأنسجة.
قسم أنسجة الورم المضمنة إلى شرائح رفيعة.
انقل شريحة إلى طبق بتري يحتوي على وسط المعالجة المثلجة للحفاظ على بنية الأنسجة.
بعد ذلك ، قم بوضع شريحة الأنسجة على غشاء قابل للاختراق في بئر يحتوي على وسط صيانة ثقافة الشرائح.
حافظ على الشريحة في الظروف الفسيولوجية. ثقافة الشرائح جاهزة للمقايسات النهائية.
ابدأ باستخدام ملقط معقم لوضع إدخالات ثقافة PTFE الفارغة في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار تحتوي على 1 مليلتر من وسط صيانة ثقافة الشرائح لكل بئر. عند إضافة جميع الإدخالات ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة المغلفة بالماء عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
بعد ذلك ، ضع قطع أنسجة الورم في طبق بتري يحتوي على وسط معالجة مثلج ، واستخدم ماصة لغسل الأنسجة برفق ثلاث مرات بوسط جديد لإزالة أي خلايا دم حمراء ملتصقة. بعد الغسيل الثالث ، استخدم مشرطا لتقطيع قطع الورم إلى شرائح 3 × 3 × 10 ملم تقريبا ، وإزالة أي أوعية متصلة بعناية وتجنب الأنسجة الميتة أو المكي.
عندما يتم قطع كل الأنسجة ، أضف 5 إلى 7 ملليلتر من 37 درجة مئوية من الاغاروز السائل في قالب تضمين بلاستيكي بحجم 2 سنتيمتر مكعب ، وقم بتبريد الاغاروز على طبقة من الجليد لمدة دقيقة واحدة. ضع 2 إلى 4 شرائح من الأنسجة في الاغاروز ، مع توجيه المحور الطويل عموديا ، مع ترك الأنسجة على الجليد لمدة 2 إلى 5 دقائق أخرى بعد وضعها.
عندما يتجمد الاغاروز ، قم بقص جوانب النموذج بمشرط لإزالة الاغاروز برفق من القالب ، واستخدم قطرة كبيرة من غراء سيانواكريليت لتثبيت كتلة الاغاروز على لوحة عينة اهتزازية.
عندما يتماسك الغراء ، اغمر كتلة الاغاروز في وسط معالجة مثلج واستخدم ماصة بلاستيكية مشذبة ومعقمة لفقاعة خليط 5٪ CO2 95٪ O2 في الوسط داخل خزان الاهتزاز. اضبط سمك شريحة الاهتزاز على 300 إلى 350 ميكرون ، واضبط السرعة المتقدمة للشفرة وسعة الشفرة وفقا لتناسق الأنسجة ومواصفات الاهتزاز.
الحصول على العدد المناسب من الشرائح وفقا للتحليل التجريبي المخطط له. استخدام ملعقة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ لنقل الشرائح إلى طبق بتري يحتوي على وسط معالجة مثلج بارد عند الحصول عليها. عندما يتم الحصول على جميع الشرائح ، استخدم الملعقة الدقيقة لنقل كل شريحة إلى ملحق PTFE واحد.
بعد حضانة من 12 إلى 24 ساعة ، قم بموازنة صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على وسط صيانة زراعة شرائح طازجة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 15 دقيقة. ثم استخدم ملقطا معقما لفهم كل ملحق من الحافة ، ونقل الإدخالات إلى آبار فردية من الصفيحة الجديدة المكونة من ستة آبار.