تطوير نموذج زراعة الخلايا الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري

ابدأ بإضافة الحمض إلى الجانب السفلي من إدخال البئر.

قم بتغطية إدراج البئر بلوحة ثقافة واحتضنها.

تلتصق الخلايا الحمضية بغشاء البئر ، وتشكل طبقة أحادية الخلية أو طبقة أحادية.

خذ لوحة ثقافة أخرى.

أضف الخلايا النجمية البشرية إلى البئر في وسط مناسب. ثم احتضن اللوحة.

تلتصق الخلايا النجمية بقاع البئر وتشكل طبقة أحادية.

تخلص من الوسط وأضف الخلايا النجمية الطازجة ووسط الحضج.

الآن ، خذ لوحة الثقافة التي تحتوي على إدراج البئر مع طبقة الحضج.

اقلب اللوحة وانقل البئر إلى البئر الذي يحتوي على طبقة الخلايا النجمية.

أضف الخلايا البطانية للدماغ البشري إلى الجانب العلوي من البئر ، وأدخل واحتضن.

ترتبط الخلايا البطانية بإدخال البئر ، وتشكل نظام ثقافة ثلاثي الخلايا يشبه الحاجز الدموي الدماغي ، وهو واجهة حاسمة تفصل مجرى الدم والدماغ.

ابدأ بزراعة HBVP في قوارير استزراع T75 بسطح نشط للتصاق الخلايا داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى التقاء. بمجرد الوصول إلى التقاء ، استنشق وسط الطفيلي القديم واغسل الخلايا ب 5 ملليلتر من برنامج تلفزيون Dulbecco الدافئ. قم بشفط PBS الخاص ب Dulbecco وافصل الخلايا عن القارورة ، باستخدام مزيج من 4 ملليلتر من محلول التربسين-EDTA الدافئ و 1 مليلتر من Dulbecco's PBS.

احتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. انظر تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة. أضف 5 ملليلتر من وسط الطفيليات الدافئة ، التي تحتوي على 2٪ FBS إلى القارورة ، وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة ثلاث دقائق عند 200 جم ، مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبات في قاع الأنبوب.

استنشق الوسط من الأنبوب, ضمان بقاء حبيبات الخلية سليمة. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط طفيلي. احسب كمية الوسط ، اعتمادا على التقاء الخلايا وعدد إدخالات البئر المطلوبة. خذ 10 ميكرولترات من الخلايا المعلقة. ضعها في شريحة عد الخلايا ، واحسب عدد الخلايا.

حدد كثافة الخلية وبذرة 300,000 خلية لكل إدراج في 1 مليلتر من وسط الطفيلي على الجانب اللمعي من إدراج البئر. قم بزراعة الخلايا النجمية البشرية الأولية باستخدام وسط الخلايا النجمية ، الذي يحتوي على 2٪ FBS ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. حدد كثافة الخلايا وبذر 300,000 خلية لكل بئر في قاع صفائح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار. قم بتغطية اللوحة لمنع التبخر ، واحتضانها طوال الليل.

أخرج زراعة الأنسجة ذات 6 ألواح تحتوي على الخلايا النجمية في إدخالات البئر التي تحتوي على خلايا محيطية من الحاضنة. استنشق وسط الخلايا النجمية من ألواح ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار ، وأضف 1 مليلتر من وسط الطفيليات و 1 مليلتر من وسط الخلايا النجمية إلى كل بئر.

استنشق وسط الحضاق من إدخالات البئر ، وضعها في صفائح ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على الخلايا النجمية المصنفة. بذور HBMEC بكثافة 300,000 خلية لكل بئر في 2 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجانب القمي من نفس إدراج البئر.