JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 4:02 د • July 8th, 2025
ابدأ بالغلاف الدبقي ، وهي مجاميع الخلايا المشتقة من ورم في المخ أو الورم الأرومي الدبقي.
أضف إنزيمات التفكك. احتضان لفصل خلايا الورم الأرومي الدبقي والحصول على معلق أحادي الخلية.
بعد ذلك ، أدخل وسيطا مثقفا غني بالمصل لإيقاف نشاط الإنزيم.
جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة تعليق الخلايا.
قم بتصفية التعليق ، ثم جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.
أعد تعليق الخلايا في سلائف هيدروجيل تحتوي على ببتيدات صغيرة.
قم بتحميل هذا الخليط في الآبار باستخدام قالب سيليكون مجمع مسبقا يحتوي على حمض الهيالورونيك.
امزج المحلول. احتضان للسماح بالتفاعل بين حمض الهيالورونيك وسلائف الهيدروجيل ، وتشكيل هيدروجيل يسهل انحباس الخلايا.
تراكب الهيدروجيل بوسط الاستزراع للحفاظ على بقاء الخلايا.
بعد تفكيك القالب ، احتضان الهيدروجيل.
داخل الهيدروجيل ، تتفاعل بروتينات الالتصاق على الخلايا مع الببتيدات السليفة وحمض الهيالورونيك.
هذا يتسبب في تكوين الخلايا لمجموعات صغيرة وتطوير ثقافة ثلاثية الأبعاد.
للبدء ، ضع قوالب مطاط السيليكون النظيفة والجافة في كل بئر من صفيحة 12 بئرا غير معالجة بزراعة الأنسجة ، واستخدم الطرف الحاد النظيف لطرف الماصة للصق القوالب في قاع اللوحة. بعد فحص الختم بين القوالب وقيعان البئر ، اجمع كرات الورم الدبقي المنفصلة من زراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من إنزيم تفكك الخلية.
بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بتحريك الأنبوب بنقرة لطيفة وإيقاف التفاعل الأنزيمي بأربعة ملليلتر من الوسط الكامل. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط كامل طازج قبل إجهاد الخلايا من خلال مرشح 70 ميكرومتر. اغسل المصفاة بأربعة ملليلتر إضافية من الوسط الكامل وقسم التعليق إلى قسمين من 8 × 104 خلايا لكل أنبوب طرد مركزي.
اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق حبة واحدة في 80 ميكرولتر من البولي إيثيلين جلايكول ماليميد المحضر حديثا ، أو PEG-Mal-RGD ، وحبيبات واحدة في 80 ميكرولتر من محلول PEG-Mal-CYS المحضر حديثا لكل قالب. باستخدام طرف ماصة دقيقة بفتحة عريضة سعة 200 ميكرولتر ، أضف 40 ميكرولترا من محلول حمض الهيالورونيك في كل قالب سيليكون مطاطي ، متبوعا ب 40 ميكرولترا من محلول الخلية PEG-Mal-CYS أو PEG-Mal-RGD ، مع سحب العينات بسرعة لأعلى ولأسفل بما لا يزيد عن 10 مرات لكل قالب للخلط.
نظرا لوقت التبلور السريع، بمجرد خلط مكوني الهيدروجيل، من المهم استخدام طرف ماصة واسع الفتحة لخلط المحاليل معا بسرعة وبدقة. هذه الخطوة تتطلب الممارسة.
بعد ذلك ، ضع الخلايا المغلفة بالهلام في حاضنة ثقافة خلايا 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 إلى 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 2 إلى 2.5 مل من وسط المزرعة إلى كل هلام واستخدم طرف ماصة معقم سعة ميكرولتر وملقط لفصل المواد الهلامية برفق عن جوانب القوالب. بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لإزالة القوالب من آبار الألواح وإعادة اللوحة إلى حاضنة الخلية.