تحليل بقاء خلايا بركنجي في مزارع شرائح المخيخ العضوية

ابدأ بدماغ جرو الفأر.

عزل المخيخ والحصول على شرائح الأنسجة بسماكة مناسبة.

انقل الشرائح إلى إدخالات غشائية موضوعة داخل آبار لوحة الثقافة التي تحتوي على وسائط.

في الآبار المعالجة ، تحتوي الوسائط على مركب اختبار واقية من الأعصاب. تفتقر آبار التحكم إلى المركب. حضن.

في ظل ظروف التحكم ، تخضع خلايا بركنجي المخيخية لموت الخلايا المبرمج ، مما يحاكي التطور المبكر بعد الولادة في الجسم الحي.

في الآبار المعالجة ، اعتمادا على إمكاناته ، قد يحمي المركب الخلايا من موت الخلايا المبرمج.

اغسل الشرائح وقم بإصلاحها للحفاظ على سلامة الخلوية.

انقل الشرائح إلى محلول مانع للنفاذية لاختراق أغشية الخلايا وسد مواقع الارتباط غير المحددة.

تراكب مع الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتين مرتبط بالكالسيوم يتم التعبير عنه على وجه التحديد في خلايا بركنجي.

غسل وإدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

قم بتلطيخ النوى بصبغة ملزمة للحمض النووي وقم بتركيب الشرائح.

باستخدام مجهر متحد البؤر ، حدد كمية خلايا بركنجي القابلة للحياة لتحديد إمكانات الحماية العصبية لمركب الاختبار

لحصاد المخيخ ، استخدم ملقط ضمادة مستقيمة لإمساك رأس الجرو من الأنف ، واستخدم مقص العين المستقيم لفتح فروة الرأس من الطرف الخلفي بشكل جانبي إلى خط الوسط. افتح الجمجمة بنفس الطريقة ، مع توجيه أطراف المقص للخارج لتجنب إتلاف المخيخ ، واستخدم ملعقة لنقل الدماغ إلى طبق 60 ملم يحتوي على HBSS بارد و 5 ملليغرام لكل مليلتر من الجلوكوز.

استخدم ملقط الضمادات المستقيمة لتشريح المخيخ بعناية ، واستخدم ملقطا دقيقا منحنيا معقما لوضع الأنسجة على قرص بلاستيكي على طاولة التقطيع في مفرمة المناديل. قم بتدوير طاولة القطع لتوجيه الأنسجة للسماح بالحصول على أقسام طفيلية ، واسحب مقبض تحرير الطاولة إلى اليمين لتحريك طاولة القطع حتى يتم وضع الشفرة على حافة الأنسجة. ثم اضبط سمك الشريحة على 350 ميكرومتر وسرعة الشفرة إلى متوسطة وابدأ تشغيل المروحية. عندما يتم تقطيع المخيخ بالكامل ، قم بإيقاف تشغيل المفرمة.

باستخدام ملقط معقم ، أمسك القرص فوق طبق جديد بحجم 60 ملم. استخدم ماصة نقل لغسل HBSS بالإضافة إلى الجلوكوز فوق القرص حتى تسقط الشرائح في الطبق. بعد ذلك ، عند لمس العينات بأقل قدر ممكن ، استخدم مسبارا دقيقا لفصل الشرائح.

استخدم ماصة النقل لتحديد أقسام المخيخ القريبة من الدودة على إدخالات زراعة الخلايا الفردية في الصفيحة المكونة من ستة آبار، واستخدم المسبار الدقيق لوضع الشرائح في وسط كل إدخال. عندما يتم وضع جميع الشرائح ، قم بشفط أي فائض من HBSS بالإضافة إلى الجلوكوز بعناية وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا.

لتلوين التألق المناعي ، قم بإزالة المادة الطافية من كل بئر واغسل الإدخالات باستخدام PBS. ثبت الشرائح مع 1 ملليلتر من بارد 4 ٪ بارافورمالدهايد في بئر كل ملحق ، و 500 ميكرولتر فوق كل ملحق لمدة 1 ساعة.

في نهاية التثبيت ، اغسل الإدخالات أربع مرات لمدة 10 دقائق مع 1 مليلتر من PBS الطازج تحت كل ملحق و 500 ميكرولتر من PBS الطازج أعلى كل ملحق لكل غسلة على شاكر مداري. املأ مسبقا كل بئر من صفيحة 24 بئرا ب 500 ميكرولتر من PBS-TB ، واستخدم فرشاة الرسم لنقل شرائح المخيخ من كل إدراج مزرعة خلوية إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئرا.

نفاذية وحظر الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، قم بتسمية الخلايا ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية المخفف في PBS-TB لكل بئر بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على شاكر المدار.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح أربع مرات لمدة 10 دقائق و 500 ميكرولتر من PBS الطازج لكل غسلة على الخلاط قبل وضع العلامات على العينات بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة المترافقة بالفلوروفور لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر محمي من الضوء.

في نهاية الحضانة ، قم بمضاد وصمة عار الأقسام ب 500 ميكرولتر من بقعة نووية مناسبة لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء ، واستخدم ماصة نقل لتركيب الشرائح على شرائح زجاجية.

بعد ذلك ، اترك الأقسام تجف تماما في الهواء قبل إعادة الترطيب باستخدام PBS وتركيب المناديل بأغطية مطلية بحوالي 80 ميكرولترا من وسط التثبيت. بمجرد أن يعالج وسط التركيب ، تكون أقسام المخيخ جاهزة للتصوير.