تقنية لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

ابدأ بمستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان المزروعة على مصفوفة غشاء القاعدي الملتصقة.

أضف وسيطا للتمايز المخيخي يحتوي على هرمون معين وعامل نمو ومثبطات جزيئات صغيرة.

ارفع المستعمرات باستخدام ماصة زجاجية ، وانقلها إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية.

يحافظ السطح منخفض التعلق على الخلايا في حالة تعليق ، مما يسهل تجميعها في أجسام جنينية ثلاثية الأبعاد ، أو EBs.

يرتبط الهرمون وعامل النمو والمثبطات بالمواقع المستهدفة الخاصة بها ، مما يعزز تمايز الخلايا الجذعية إلى أسلاف عصبية.

انقل EBs إلى آبار لوحة الاستزراع المطلية ببوليمر اصطناعي وبروتين الالتصاق لتسهيل الارتباط بالإي بي.

استبدل الوسط بوسط تمايز خال من المثبطات.

تبدأ الخلايا في الهجرة إلى الخارج من EBs ، وتشكل طبقة أحادية ثنائية الأبعاد.

قم بإزالة الوسط وأضف وسط نضج المخيخ.

تحفز عوامل النمو في الوسط نضوج الأسلاف العصبية إلى سلائف عصبية مخيخية مميزة.

في اليوم صفر ، أضف 1 مليلتر من وسط التمايز المخيخي المكمل ب 10 ميكرومولار Y27632 و SB431542 إلى كل بئر من ستة آبار مرفق منخفض للغاية أو صفيحة ULA ، وضعها في الحاضنة حتى تصبح المستعمرات المرفوعة جاهزة للإضافة إلى الآبار. قم بتنظيف الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة. شفط الوسط, وإضافة 1 ملليلتر من محلول تمرير iPSC لكل طبق 35 ملم.

بعد ثلاث دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، استنشق الوسط وأضف 2 مل من وسط التمايز المخيخي مع 10 ميكرومولار Y27632 و SB431542. تحت تكبير 4X لمجهر مقلوب ضوئي مرسل، ارفع المستعمرات باستخدام الحافة المنحنية للماصة الزجاجية المسحوبة. بمجرد رفع كل مستعمرة ، انقل جميع المستعمرات برفق إلى بئر واحد من صفيحة ULA المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر. كرر هذه العملية لكل لوحة iPSC, واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم 2 ، أضف FGF2 إلى كل بئر لضبط التركيز النهائي البالغ 50 نانوغرام لكل ملليلتر. في اليوم 7 ، قم بتغيير ثلث الوسيط عن طريق شفط 1 مليلتر من الوسط المستهلك ، واستبداله ب 1 ملليلتر من وسط التمايز المخيخي الطازج. احتضان الأجسام الجنينية لمدة سبعة أيام.

في اليوم 14 ، قم بتدوير اللوحة لتجميع كل الأجسام الجنينية في وسط اللوحة. بعد ذلك ، قم بإمالة اللوحة ، وشفط كل الوسط المستهلك باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر من الحافة. مع انخفاض الكمية المتوسطة ، ضع اللوحة ببطء بشكل مسطح واستمر في الشفط ، مع ترك وسيط كاف لتجنب تجفيف الأجسام الجنينية.

بعد ذلك ، أضف 3 ملليلتر من وسط التمايز المخيخي الطازج المكمل ب 10 ميكرومولار. Y27632. بعد ذلك ، انقل الأجسام الجنينية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر إلى طبق مغطى بلامينين بولي إل أورنيثين. في اليوم 15 ، استنشق الوسط واستبدله بوسط تمايز المخيخ الطازج.