عزل واستزراع أسلاف الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الفئران

خذ جرو الفأر المخيخ.

تجانسها إلى أجزاء أصغر.

أضف إنزيما محللا للبروتين لهضم المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، وتخفيف الأسلاف الحبيبية المخيخية ، أو CGNPs ، والخلايا النجمية.

إضافة وسائط مزرعة CGNP تحتوي على مصل لإيقاف النشاط الأنزيمي. جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية الغنية بالإنزيم.

أعد تعليق شظايا الأنسجة في وسائط CGNP. قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا لتحرير الخلايا.

بمجرد أن يستقر الحطام ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا إلى أنبوب جديد.

جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية مع الحطام.

أعد تعليق الخلايا في وسائط CGNP ، وبذرها في آبار صفائح متعددة الآبار مطلية ب poly-D-lysine. حضن.

تستقر الخلايا النجمية وتلتصق بقوة بطلاء بولي دي ليسين ، مقارنة ب CGNPs.

رج اللوحة واجمع المادة الطافية التي تحتوي على CGNPs. جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق CGNPs في وسائط CGNP وبذرها على صفيحة متعددة الآبار مطلية ب poly-L-ornithine. حضن.

تلتصق CGNPs بالسطح المطلي وتتكاثر ، بمساعدة مكونات الوسائط و poly-L-ornithine.

انقل ثلاثة إلى خمسة مخيخ إلى أنابيب سعة 15 ملليلترا. اغسل المخيخ بالجلوكوز HBSS قبل الطرد المركزي. الطرد المركزي الأنابيب لجمع الأنسجة. بعد الغسيل النهائي ، قم بتجانس المخيخ عن طريق ماصة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام ماصة سعة 1 مليلتر حتى يصبح حجم الشظايا من 0.5 إلى 1 مليمتر مكعب.

قم بإزالة كل السوائل برفق حتى يتبقى 2.5 مل. ثم أضف 0.05٪ تربسين إلى الأنبوب الذي يحتوي على جلوكوز HBSS الذي يحتوي على المخيخ ، واحتضان الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اقلب الأنسجة كل 1 إلى 3 دقائق. بعد الحضانة ، أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة 5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا cGMP أو CGM ، واجمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإضافة 1 مليلتر من المراقبة المستمرة للجلوكوز قم بترتيورات الأنسجة بطرف الماصة سعة 1 مليلتر ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء. ثم أضف 5 مل من المراقبة المستمرة للمراقبة المستمرة ، واحتضن الخليط لمدة دقيقتين على الثلج لتسوية بقايا الأنسجة. بمجرد أن يستقر النسيج ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. ثم أضف 2 مل من المراقبة المستمرة للجلوكوز إلى الأنسجة المتبقية ، وكرر إجراء التخلي قبل حصاد المادة الطافية والتخلص من بقايا الأنسجة.

قم بتجميع المواد الطافية من كل أنبوب سعة 15 مليلتر من الأنسجة ، وأجهزة الطرد المركزي لجمع الخلايا المخيخية. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من المراقبة المستمرة للسكري. نظرا لأن الخلايا النجمية تلتصق بشكل أسرع وأقوى ب poly-D-lysine من cGMPs ، أضف ما يصل إلى 4 ملليلتر من تعليق الخلية إلى آبار ألواح 6 آبار مطلية ب poly-D-lysine ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الخلايا النجمية.

رج اللوحة. اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للطافية كما كان من قبل. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من CGM ، واحسب الخلايا بغرفة عد Neubauer. بعد 4 إلى 6 ساعات ، تظهر ممارسات التصنيع الجيدة الملتصقة مستديرة ومتاثرة. قم بزرع الخلايا في CGM على ألواح مطلية ب poly-L-ornithine ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، و 100٪ رطوبة نسبية.