توليد الكرات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

ابدأ بمستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو hPSCs المرتبطة بركيزة مناسبة في وسط الاستزراع.

قم بإزالة الوسيط. أضف وسيطا عصبيا يحتوي على مثبطات محددة واحتضنها.

توجه هذه المثبطات نضوج hPSCs نحو سلالة عصبية ، وتشكل مستعمرات الأديم العصبي. هذه سلائف لهياكل كروية صغيرة تسمى الكرويات.

قم بإزالة الوسط واغسله بمحلول ملح.

احتضان بإنزيم هضمي لفصل المستعمرات عن اللوحة.

أضف الوسط العصبي لإيقاف النشاط الأنزيمي.

اجمع المستعمرات وانقلها إلى أنبوب.

اسمح لهم بالاستقرار ، ثم تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق المستعمرات في وسط عصبي يحتوي على عامل نمو.

انقل المستعمرات إلى طبق متعدد الآبار واحتضنها.

يسهل عامل النمو هذا التنظيم الذاتي وتكاثر خلايا الأديم العصبي ، مما يؤدي بها إلى تكوين كروي.

للبدء ، قم بوضع مستعمرات hPSC على مصفوفة غشاء قاعدي مؤهلة من hESC من بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار عند التقاء 60٪ في ثلاثة آبار لتحقيق كثافة 20٪ إلى 30٪ ، ثم المضي قدما في تحريض مستعمرات الأديم العصبي 2D.

أضف وسائط N2 جديدة مكملة بمثبطات SMAD المزدوجة يوميا لكل بئر لمدة 3 أيام قادمة. لتوليد كرويات الأديم العصبي ثلاثي الأبعاد من مستعمرات الأديم العصبي 2D المستحثة ، قم بإزالة 2 مل من وسط N2 من اللوحة المكونة من 6 آبار ، واغسلها مرة واحدة باستخدام HBSS لضمان إزالة كل وسط N2.

أضف 1 مليلتر من التباعد إلى كل بئر يحتوي على مستعمرة. احتضن اللوحة لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وتحقق من انفصال المستعمرة بانتظام. في نهاية الحضانة ، لإيقاف نشاط الإنزيم المنفصل ، أضف 1 مليلتر من N2 وسط إلى البئر. باستخدام طرف ماصة P1000 عريض التجويف أو كوب طرف ماصة P1000 معدل بمقص معقم ، انقل المستعمرات إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، واترك كتل المستعمرة تغرق في قاع الأنبوب بالجاذبية.

بعد ذلك، باستخدام طرف ماصة P1000 القياسي، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. استبدله ب 1 مليلتر من وسط N2 الطازج ، وكرر الغسيل ثلاث مرات لضمان الإزالة الكاملة للتباعد. بعد إعادة تعليق كتل الخلية و N2 وسط ، انقل معلق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار ، وأضف 40 نانوغرام لكل مليلتر من bFGF.