عزل الخلايا الجذعية من مخيخ الفأر بعد الولادة والتمايز إلى خلايا عصبية

خذ الخلايا المعزولة من مخيخ الفأر حديث الولادة الذي يحتوي على الخلايا الجذعية والخلايا العصبية والدبقية.

أضف الميكروبيدات المغناطيسية المغلفة بالأجسام المضادة والتي ترتبط ببروتين سكري سطحي خاص بالخلايا الجذعية.

جهاز الطرد المركزي ، وإزالة الخرزات غير المقيدة ، وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

قم بتحميل الخلايا على عمود فصل يوضع في فاصل مغناطيسي ، والذي يحتفظ بالخلايا الجذعية المرتبطة بالميكروبيدات بينما تتدفق الخلايا الأخرى من خلالها.

أضف وسيطا للغلاف العصبي لتصفية الخلايا ونقلها إلى صفيحة دقيقة. احتضان للحث على تكوين المجالات العصبية الأولية ، ومستعمرات الخلايا الجذعية ذاتية التجديد.

جهاز طرد مركزي وتجاهل الوسيط. أعد تعليق المجالات العصبية في وسط يحتوي على إنزيمات لهضم بروتينات الالتصاق الخلوي.

أجهزة الطرد المركزي وإزالة الإنزيمات. أضف وسط الغلاف العصبي وفصل الخلايا ميكانيكيا.

احتضان للسماح بتكاثر الخلايا الجذعية وتكوين الغلاف العصبي الثانوي ، في حين أن الخلايا المتمايزة التي تفتقر إلى خصائص الخلايا الجذعية لا تتكاثر.

انقل المجالات العصبية إلى وسط تمايز واحتضانها ، مما يعزز التمايز إلى الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد ، ثم قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. قم بتغطية الفلتر ب 10 مل من محلول HBSS المثلج ، لضمان مرور الخلايا عبر الشبكة.

انقل الخلايا المفلترة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 300 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم استخدم شفاط فراغ لإزالة المادة الطافية تماما.

أعد تعليق حبيبات الخلية في 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمود المغناطيسي المثلج. أضف 40 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة للبرومينين -1 إلى تعليق الخلية. بعد ذلك ، احتضن الأنابيب في الثلاجة لمدة 15 دقيقة ، للسماح للجسم المضاد بالارتباط بالخلايا التي تعبر عن البرومينين 1.

اغسل الخلايا ب 1 إلى 2 مل من العمود العازل X ، وقم بالطرد المركزي لها بمعدل 300 مرة جم لمدة 10 دقائق. قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من العمود العازل X. ضع الأعمدة المغناطيسية على الحامل المغناطيسي ، واشطفها مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X. ضع تعليق الخلية المسمى على العمود ، واجمع التدفق في أنابيب جديدة سعة 15 ملليلترا.

اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X. ثم قم بإزالة الأعمدة من المجال المغناطيسي وضعها في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. أضف 1 مليلتر من وسط الثقافة ، وادفع المكبس في العمود لطرد الخلايا الموسومة بخرز برومينين -1.

لتمرير المجالات العصبية ، قم بنقلها جنبا إلى جنب مع وسط الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلترا. حبيبات المجالات العصبية عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة غرام لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر من وسط التفكك باستخدام غراء أو محلول تربسين 0.05٪ ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 5 ملليلتر من وسط الغلاف العصبي ، وفصلها عن طريق ماصتها ببطء لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة المراعي. قم بوضع الخلايا في وسط الغلاف العصبي كما هو موضح في بروتوكول النص ، وقم بإثرائها بالمجالات العصبية الثانوية بعد 7 إلى 10 أيام في الثقافة كما هو موضح سابقا.