JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 3:49 د • July 8th, 2025
ابدأ بعضلة رأس الفئران وقم بتقطيعها إلى شظايا.
أضف مزيجا من الإنزيمات المحللة للبروتين واحتضن مع رج لطيف.
تهضم الإنزيمات المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، مما يؤدي إلى إرخاء ألياف العضلات.
أضف وسائط تحتوي على بروتينات المصل لتعطيل الإنزيمات.
انقل الأنسجة إلى أنبوب ، وجهاز طرد مركزي ، وتخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الأنسجة في الوسط. كرر التعطيل الميكانيكي والطرد المركزي مرتين للحصول على تعليق متجانس للخلايا الساتلية - الخلايا الجذعية الضرورية لإصلاح العضلات وتجديدها.
اجمع المادة الطافية المحتوية على خلية الأقمار الصناعية.
مرر عبر مصفاة خلية للحصول على تعليق أحادي الخلية. جهاز الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في الوسائط.
ضع قطرات من تعليق الخلية على آبار الغرفة المغلفة بالبروتين خارج الخلية.
يسهلالسطح المطلي ربط خلية الأقمار الصناعية. أضف الوسائط إلى الآبار.
تحفز عوامل النمو في الوسائط تكاثر الخلايا الساتلية وتمايزها إلى الخلايا العضلية - سلائف الخلايا العضلية ، والتي تتكاثر وتندمج لتشكيل أنابيب عضلية متعددة النواة.
تنضج الأنابيب العضلية في النهاية إلى ألياف عضلية.
لعزل الخلايا الساتلية ، انقل كل عضلة إلى آبار فردية من صفيحة من ستة آبار ، وقم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة بحجم 2 ملم ، مع الحرص على عدم فرم العضلات كثيرا. بعد ذلك ، احتضان شظايا الأنسجة بعناية في 2.5 مل من محلول بروناز 0.1٪ لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، مع رج لطيف ، كل 20 دقيقة.
عندما تظهر حزم الألياف مظهرا خفيا ، أضف 2.5 مل من DMEM ، مع مصل الحصان والمضادات الحيوية إلى كل بئر ، وانقل الأنسجة المهضومة إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مل. قم بتدوير ملاط الأنسجة ، وصب المواد الطافية. ثم أضف 5 ملليلتر من الوسط إلى كل أنبوب ، وقم بتجانس الأنسجة بماصة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر.
قم بتدوير الأنسجة مرة أخرى ونقل المواد الطافية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف 5 ملليلتر أخرى من الوسط إلى الأنابيب ، وقم بتقطيع قطع الأنسجة مرة أخرى حتى تمر الشظايا بسهولة عبر الماصة.
بعد طرد مركزي آخر ، قم بتجميع المواد الطافية في الأنابيب المقابلة المناسبة ، وقم بتصفية معلقات الخلية من خلال مصافي 40 ميكرومتر في أنابيب فردية سعة 50 ملليلترا. اغسل المصافي ب 1 ملليلتر من DMEM لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا. ثم قم بتدوير الخلايا. أعد تعليق الكريات في وسط جديد وعد الخلايا.
لزراعة الخلايا الساتلية المعزولة ، بعد ذلك ، قم بتخفيف معلقات الخلية إلى 1.5 × 103 خلايا لكل 10 ميكرولتر من وسط الاستزراع. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بقعة هلامية مصفوفة خارج الخلية معدة مسبقا واحتضان المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية. بعد ست ساعات ، أضف بعناية 400 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى كل بقعة هلامية ، وأعد الشرائح إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام ، ابدأ في تمايز الخلايا بإضافة وسط الثقافة المناسب.