تكوين الخلايا العصبية الناجم عن حمض الريتينويك باستخدام خلايا سرطان الفئران الجنيني

خذ معلق خلايا سرطان جنين الفأر قادر على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.

خلايا البذور على طبق استزراع مسعور يحتوي على وسائط وحمض الريتينويك.

حضن. تمنع الأسطح الكارهة للماء التصاق الخلايا ، مما يتسبب في تكوين الخلايا للمجاميع.

يدخل حمض الريتينويك إلى مجاميع الخلايا ، مما يؤدي إلى مسارات الإشارات ويسبب التمايز إلى الخلايا السلفية العصبية.

بعد الحضانة ، اجمع مجاميع الخلية.

تجاهل الوسائط.

أضف الوسائط التي تحتوي على حمض الريتينويك وقم بزرع الركام في طبق استزراع كاره للماء.

حضن. يسهل حمض الريتينويك التمايز الخلوي المستدام إلى الخلايا العصبية.

اجمع المجاميع وقم بإزالة الوسائط.

أضف إنزيما محللا للبروتين لتعطيل التصاقات الخلايا الخلوية داخل المجاميع.

أضف وسائط تحتوي على مصل لإيقاف النشاط الأنزيمي.

فصل الركام ميكانيكيا ، وتشكيل تعليق عصبي.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية الغنية بالإنزيم.

أعد تعليق الخلايا العصبية في الوسائط وبذرها على صفيحة ملتصقة متعددة الآبار تحتوي على وسائط.

حضن. تلتصق الخلايا العصبية بالصفيحة وتنضج ، وتمتد الإسقاطات الطويلة.

لتوليد الركام ، ابدأ بإضافة 10 ملليلتر من وسط التمايز المكمل ب 5 ميكرولتر من RA إلى طبق استزراع غير معالج سعة 100 مل. قم بزرع 1 مليون خلية في طبق الاستزراع ، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين من أجل تعزيز تكوين الركام.

بعد الحضانة ، باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ، قم بشفط الوسط الذي يحتوي على الركام ونقله إلى أنبوب سعة 15 مليلتر في درجة حرارة الغرفة. انتظر لمدة 1.5 دقيقة حتى تستقر الركام في القاع ، ثم تخلص من المادة الطافية.

أضف 10 مل من وسط التمايز الطازج المكمل ب 0.5 ميكرومولار RA. قم بزرع الركام برفق في طبق استزراع جديد غير معالج بحجم 100 ملم ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين.

للبدء ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل مجاميع الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. انتظر لمدة 1.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تستقر الركام في القاع ، ثم تخلص من المادة الطافية. اغسل الركام بمصل وDMEM الخالي من المضادات الحيوية. انتظر حتى تستقر مجاميع الخلايا في الأسفل. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 2 مل من 0.25٪ تربسين EDTA.

احتضان الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مع النقر كل دقيقتين لإبقاء الخلايا معلقة. بعد ذلك، أضف 4 ملليلتر من وسيط الصيانة لإيقاف نشاط التربسين، وقم برفع وهبوط الماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام ماصة سعة 1 ملليلتر.

أخيرا ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط الصيانة. استخدم عداد الخلايا لتحديد رقم الخلية والمضي قدما في طلاء الخلايا. إلى خلايا الصفيحة ، أولا ، أضف 3 ملليلتر لكل بئر من وسط الصيانة إلى لوحة ثقافة مكونة من ستة آبار. ثم قم بزرع الخلايا بكثافة 500,000 لكل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.