JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 2:25 د • July 8th, 2025
ابدأ بالخلايا الجذعية الجنينية المزروعة فوق طبقة من الخلايا المغذية للأرومات الليفية ، والتي تحافظ على الخلايا الجذعية في حالتها غير المتمايزة.
أضف إنزيمات التربسين و EDTA لتعطيل الالتصاق من خلية إلى أخرى وفصل الخلايا.
في وقت لاحق ، أضف وسط ثقافة غني بالمصل لإيقاف نشاط الإنزيم ، وانقل معلق الخلية إلى أنبوب.
جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في وسط يحتوي على حمض الريتينويك.
ضع قطرات من معلق الخلية هذا على قاعدة طبق ثقافة غير لاصق.
اقلب القاعدة لتشكيل قطرات معلقة وضعها فوق غطاء طبق الاستزراع المملوء بمخزن مؤقت لمنع القطرات من الجفاف.
في القطرات المعلقة ، تتسبب الجاذبية في استقرار الخلايا في القاع ، وتتراكم في النهاية في هياكل ثلاثية الأبعاد تسمى الأجسام الجنينية.
علاوة على ذلك ، تمتص الخلايا حمض الريتينويك ، الذي يعدل مسارات الإشارات المختلفة داخل الخلايا.
يحفز هذا التعديل تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا سلفة عصبية ذات قدرة على إنتاج الخلايا العصبية.
ابدأ تكوين الجسم الجنيني عن طريق حصاد الخلايا الجذعية الجنينية بنسبة 0.25٪ تريبسين-EDTA لمدة 2 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أضف وسيط Dulbecco المعدل من Iscove الطازج أو IMDM مع 15٪ FBS إلى الخلايا المنفصلة ، ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.
جهاز طرد مركزي عند 160 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم وقم بإعداد معلق 5 × 105 خلايا لكل مليلتر في IMDM مع 0.5 ميكرومولار حمض الريتينويك. بعد ذلك، استخدم ماصة ذات 8 قنوات وأطراف سعة 200 ميكرولتر لطلاء قطرات سعة 120 ميكرولتر لكل طبق بتري سعة 100 مل. اقلب الطبق واملأ الغطاء المقلوب ب PBS لمنع القطرات المعلقة من الجفاف. استزراع عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 إلى 4 أيام.