اختبار النخاع الناجم عن التنبيغ في المختبر لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن

خذ الثقافات الملتصقة للخلايا السليفة قليلة التغصن الأولية ، أو OPCs ، في وسط النمو.

أضف نواقل الفيروسات القشرية للتحكم إلى بئر التحكم وناقلات الاختبار ، وترميز بروتينات الإشارات التي تنظم تكوين النخاع ، إلى بئر الاختبار ، ثم احتضنها.

تستوعب الخلايا النواقل ، ويتم نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي بشكل عكسي إلى الحمض النووي ودمجه في جينوم المضيف ، مما يعبر عن بروتينات الإشارات في خلايا الاختبار.

إدخال الإنزيمات لفصل OPCs عن الركيزة.

تحييد الإنزيمات وأجهزة الطرد المركزي لإزالة الإنزيمات.

أضف وسط النمو وانقل OPCs إلى أغطية داخل صفيحة دقيقة مع عقدة جذر ظهرية ملتصقة أو خلايا عصبية DRG. اسمح ل OPCs بالاستقرار.

املأ الآبار بوسط النمو واحتضنها. يؤدي التفاعل مع الخلايا العصبية DRG إلى نضوج OPC إلى الخلايا قليلة التغصن.

تحفز بروتينات الإشارات المعبر عنها الخلايا قليلة التغصن على تكوين أغلفة المايلين حول الخلايا العصبية DRG.

تقييم تكوين غمد المايلين الناجم عن بروتين الإشارات في خلايا الاختبار مقارنة بالخلايا المنقولة بالنواقل التحكمية.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، لديك خلايا سلائف قليلة التغصن الأولية ، OPCs ، مستزرعة في ألواح 10 سم مع 10 ملليلتر من وسائط SATO التي تحتوي على عوامل النمو التالية - CNTF و PDGF و NT3 و Forskolin. يجب أن تكون الخلايا قد تمت زراعتها لمدة 24 ساعة تحت 8٪ ثاني أكسيد الكربون.

ابدأ بشفط الوسائط وقم بإزالتها تماما. ثم استبدلها ب 10 مل من نفس الوسائط بعوامل النمو. تصيب OPCs الخاصة بك مع فيروس العدس, التعبير عن البروتين محل الاهتمام عن طريق إضافة الحجم المطلوب من الفيروس بالتنقيط في الوسائط.

أيضا ، في لوحة OPC منفصلة ، امزج فيروس العدسات التابع للتحكم الذي يعبر عن GFP فقط في الوسائط. استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى ، ثم اجمع OPCs من الألواح للبذر على الخلايا العصبية DRG المستنبتة.

أولا ، اشطف كل طبق ب 8 ملليلتر من EBSS مرتين. اصنع 1 مليلتر من التربسين EDTA 0.05٪ مع 9 مل من EBSS الدافئ. أضف 5 مل من التربسين المخفف إلى كل طبق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى دقيقتين. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 5 ملليلتر من 30٪ FBS في EBSS.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ، اغسل OPCs من سطح اللوحة. اقلب اللوحة بمقدار ربع دورة في كل مرة لجمع كل الخلايا. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة عند 180 جم.

الآن ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر من وسائط SATO الدافئة بدون عوامل نمو ، واحسب الخلايا. بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا العصبية DRG التي يتم زراعتها على أغطية 22 ملم عن طريق شفط الوسائط بالكامل من صفيحتها.

ثم, بذرة برفق 200,000 OPCs, بالتنقيط, إلى كل غطاء. يجب أن يكون حجم البذر أقل من 200 ميكرولتر لكل غطاء. دع الخلايا تستقر دون تحريك اللوحة. بعد 10 دقائق ، ضع فوق كل بئر ملليلتر من وسائط SATO الدافئة. الآن أعد وضع OPCs الشقيقة المتبقية مع وسائط SATO التي تحتوي على عوامل النمو. يمكن استخدامها لاحقا للتحقق من التعبير عن البروتين محل الاهتمام.