عزل وثقافة الخلايا العصبية الحركية للعين والقصير الهوائية والحركية الشوكية من جنين الفأر

خذ فأرا حاملا معدلة وراثيا وقم بإزالة الرحم جراحيا باستخدام أجنة تحتوي على خلايا عصبية حركية مصنفة بالفلورسنت.

انقل الرحم إلى طبق به عازل مثلج تحت المجهر الفلوري.

استخدم الضوء المرئي لعزل الأجنة.

قم بإزالة وجه وذيل الأجنة وتوجيهها إلى وضعية الانبطاح.

باستخدام إشارة التألق ، قم بعمل شق في الدماغ الأوسط لكشف النوى الحركية للعين والبوقل ، والتي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية.

عزل الدماغ المتوسط الذي يحتوي على النوى.

افتح الجانب الظهري من الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. اعزل الحبل الشوكي ، واستئصال كلا الطرفين ، وجمع الأعمدة التي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية الشوكية.

عالج الأنسجة المجمعة بالإنزيمات لفصل مصفوفة الأنسجة. حصاد الخلايا المفردة وعزل الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت باستخدام FACS.

أضف وسيطا للثقافة إلى الخلايا العصبية المعزولة ، وانقل الخلايا إلى صفيحة دقيقة مطلية بالركيزة المزروعة ، واحتضانها ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق والنمو.

الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية في الثقافة.

ابدأ بحصاد الأجنة الإيجابية ل Islet-1 EGF من فأر حامل بعد حوالي 11.5 يوما من الإخصاب. رش البطن جيدا بالإيثانول ، وقم بإزالة الرحم بمقص تشريح مجهري معقم وملقط تضميد الإبهام. اغسل الرحم لفترة وجيزة في PBS معقم. ثم انقله إلى لوحة التشريح المملوءة ب PBS المعقم المبرد مسبقا.

تحت الضوء الساطع للمجهر ، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم باستخدام مقص التشريح المجهري ، وملقط تضميد الإبهام ، وملاقط Dumont Number 5. بعد ذلك ، استخدم ملعقة مثقبة صغيرة معقمة من Moria لنقل كل جنين إلى بئر منفصل من صفيحة مكونة من 24 بئرا مملوءة بوسط مضان منخفض من Hibernate E المبرد مسبقا مكمل ب 1X V27.

أثناء إبقاء اللوحة على الجليد ، انقل جنينا واحدا إلى لوحة تشريح معقمة ، وقم بتغطيته بالكامل بمحلول الملح المتوازن المعقم المثلج أو HBSS. استخدم الملقط لإزالة وجه الجنين والذيل دون الإضرار بالدماغ المتوسط. بعد ذلك ، ضع الجنين عرضة بأطراف متداخلة وذيل موجه نحو مقدمة المجهر.

استخدم الملقط لفتح سقف البطين الرابع لتوليد فتحة صغيرة. استخدم هذه الفتحة لربط الملقط في الفراغ الذي تم إنشاؤه بين البطين الرابع وسقفه. تشريح على طول السطح الظهري للجنين المنقاري إلى القشرة وجانبيا إلى صفيحة الأرضية والعمود الحركي.

بعد ذلك ، افتح الأنسجة التي تم تشريحها بطريقة كتاب مفتوح للكشف عن نوى CN3 و CN4 الإيجابية ل GFP. افصل الدماغ المتوسط البطني بعناية عن الجنين وقم بإزالة الأنسجة السحائية باستخدام ملاقط وسكين تشريح مجهري.

قم بتشريح نوى CN3 و CN4 الثنائية الإيجابية ل GFP بعيدا عن صفيحة الأرضية والأنسجة المحيطة الأخرى الإيجابية ل GFP ، مع الحرص على تجنب لمس الخلايا العصبية أو إتلافها. في حالة جمع نوى CN3 و CN4 منفصلة ، قم بقص الدماغ الأوسط لهاتين النواتين ، واستخدم ماصة P1000 لجمع أنسجة الدماغ الأوسط البطني المقطعة مع الحد الأدنى من HBSS.

ضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مليلتر مليء بوسط تشريح. قم بتخزين الأنبوب على الثلج حتى التفكك. استمر في تجميع الدماغ المتوسط البطني من أجنة إضافية في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية.

لتشريح الحبل الشوكي البطني ، حافظ على الجنين عرضة بحيث يكون الرأس مواجها لمقدمة المجهر. امسكها بزوج واحد من الملقط وأدخل طرف الزوج الآخر في الجزء الذيلي غير المفتوح من البطين الرابع. افتح باقي الدماغ الخلفي والحبل الشوكي ظهريا فوق المدى المنخرجي للجنين بالكامل. قطع الأنسجة الظهرية بدءا من البطين الرابع والعمل باتجاه القناة المركزية للحبل الشوكي الذيلي، باستخدام الملقط كمقص.

بعد ذلك ، أمسك الجنين بمجموعة واحدة من الملقط واضغط على سديلة الأنسجة الظهرية على كل جانب مع الزوج الآخر. قم بإزالة الحبل الشوكي البطني باستخدام سكين التشريح المجهري لاختراق SMN الإيجابي مباشرة ، ورفع الحبل الشوكي البطني بحركات تشبه المنشار على كلا الجانبين.

قطع الحبل الشوكي بشكل عرضي عند الحد العلوي للطرف السفلي ، وإزالة الجزء القطني العنقي. قطع بشكل عرضي مباشرة فوق C1 حيث يتم تطوير أول قرن أمامي إيجابي GFP. ضع الجانب الظهري للحبل الشوكي البطني لأعلى واحتفظ به عن طريق الضغط على النسيج السلبي GFP بين أعمدة SMN إيجابية GFP باستخدام زوج من الملقط.

قم بإزالة اللحمة المتوسطة المتبقية المرفقة ، و DRGs ، والحبل الشوكي الظهري عن طريق تقليم جانبي عمود SMN الإيجابي ل GFP بسكين التشريح المجهري. استخدم ماصة P1000 لجمع أنسجة الحبل الشوكي البطني المقطعة مع الحد الأدنى من HBSS ، ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مليلتر مملوء بوسط التشريح. قم بتخزينه على الجليد حتى التفكك واستمر في تجميع الحبل الشوكي البطني من أجنة إضافية في نفس الأنبوب.

أضف الحجم المناسب من محلول غراء إلى كل أنبوب من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع عينات الأنسجة التشريح. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع تحريك الأنابيب كل 10 دقائق بنقرة الإصبع.

بعد الحضانة ، قم بترتيتر كل تعليق برفق ثماني مرات باستخدام ماصة P200. جهاز الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كريات الخلية بالحجم المناسب من محلول مثبط الألبومين عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. كرر الطرد المركزي. ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة P1000. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من وسط التشريح. قم بتصفية المعلقات من خلال مصافي الخلايا 70 ميكرومتر.

بعد ذلك ، استخدم فرز FACS لعزل الخلايا الإيجابية ل GFP التي تم تشريحها من CN3 و CN4 و SMN. قم بتخفيف معلقات الخلايا المعزولة باستخدام وسط ثقافة الخلايا العصبية الحركية الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الكثافة المناسبة ، وأضف 200 ميكرولتر من التعليق إلى بئر من لوحة 96 بئر مطلية ب PDL-laminin. استزراع الخلايا العصبية في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، مع التأكد من تحديث وسط زراعة الخلايا العصبية الحركية كل خمسة أيام.