تنقية خلايا السلائف البطانية CD31 ⁺ باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

خذ مزرعة ملتصقة للخلايا السلفية البطانية أو EPCs ، وهي سلائف للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ.

تتكون المزرعة ، التي تم الحصول عليها عن طريق تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، من EPCs إيجابية لعلامة السطح CD31 والخلايا السالبة CD31 الملوثة.

احتضان كاشف تفكك لفصل الخلايا والتصفية للحصول على تعليق أحادي الخلية.

أضف وسيطا لتحييد الإنزيمات ، وجهاز طرد مركزي للتخلص من المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

احتضان بكاشف مانع لتثبيط مستقبلات Fc الخلوية ، مما يمنع وضع العلامات غير المحددة.

أضف جسما مضادا مترافقا بالفلوروفور مخصصا ل CD31 واحتضنه لتسمية EPCs.

أجهزة الطرد المركزي والتخلص من الأجسام المضادة غير المرتبطة. احتضان بمجمعات الأجسام المضادة التي تحتوي على جسم مضاد واحد يرتبط بالفلوروفور.

أدخل الجسيمات النانوية المغناطيسية المطلية بالبوليمر واحتضانها ، مما يسمح للجسيمات النانوية بالارتباط بالجسم المضاد الثاني للمجمعات.

باستخدام مجال مغناطيسي ، اعزل الخلايا المرتبطة بالجسيمات النانوية.

تخلص من التعليق بخلايا CD31 سالبة غير مصنفة وأعد تعليق الخلايا المنقاة في وسط. EPCs الإيجابية CD31 جاهزة لإجراء فحوصات المصب

في اليوم 5 من زراعة الخلايا السلفية البطانية ، قم بشفط الوسط من الآبار وأضف 1 مليلتر من كاشف التفكك إلى كل بئر. احتضن الطبق لمدة 6 إلى 8 دقائق عند 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة دقيقة ، قم بفصل الخلايا وتفردها ، ثم قم بتمرير تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر للترشيح في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط DMEM / F-12.

لإيقاف تفاعل الهضم ، أضف DMEM / F-12/10 10 متوسطا حتى علامة 50 ملليلتر. ماصة جيدا واحتفظ ب 10 ميكرولتر لحساب الخلايا. جهاز الطرد المركزي للأنبوب سعة 50 مليلتر عند 200 جم لمدة 5 دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية لحبيبات الخلايا. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 ملليلتر من وسط DMEM / F-12/10.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 جم لمدة خمس دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية لتكسير الخلايا مرة أخرى. ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت للتدفق 1. بعد ذلك ، أضف كاشف حجب FcR بنسبة 1 إلى 100 واحتضنه لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، أضف نسبة 1 إلى 200 الفلوريسين المخفف إيزوثيوسيانات أو الجسم المضاد CD31 المسمى FITC.

احتضان التعليق لمدة 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة تتراوح بين 20 و 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت للتدفق 1 إلى العينة ، واحتفظ ب 10 ميكرولتر من المعلق لتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد جزء الخلايا الإيجابية CD31. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 جم لمدة 5 دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا بمحلول عازل التدفق 1.

بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولتر من كوكتيل اختيار FITC لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. امزج المحلول جيدا عن طريق سحب العينات واحتضانه في الظلام لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين 20 و 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. قم بعرض الخليط جيدا ، واحتضنه في الظلام لمدة 10 دقائق عند 20 إلى 25 درجة مئوية.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 ملليلتر ، وأضف المخزن المؤقت للتدفق 1 للحصول على حجم إجمالي يبلغ 2.5 ملليلتر. ثم ضع أنبوب قياس التدفق الخلوي في المغناطيس لمدة خمس دقائق. في حركة مستمرة ، قم بقلب المغناطيس وصب معلق الخلية الذي يحتوي على خلايا غير مصنفة بالأجسام المضادة FITC-CD31. حافظ على المغناطيس والأنبوب في الوضع المقلوب لمدة 2 إلى 3 ثوان ، ثم قم بإزالة السائل المتبقي.

استنشق أي قطرات على حافة الأنبوب قبل إعادة الأنبوب إلى وضع رأسي. استرجع أنبوب قياس التدفق الخلوي من المغناطيس ، وأضف 2.5 مل من المخزن المؤقت للتدفق 1 لغسل الخلايا الإيجابية CD31 المتبقية. قم بسحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل، مرتين أو ثلاث مرات لإعادة تعليقها. ثم ضع أنبوب التدفق في المغناطيس لمدة خمس دقائق.

كرر الغسيل أربع مرات على الأقل لإزالة الخلايا غير المسماة FITC-CD31 من الأنبوب. قم بإزالة أنبوب التدفق من المغناطيس ، وأعد تعليق الخلايا الموجبة CD31 المنقاة بالكمية المطلوبة من الوسط المناسب. احتفظ بحصتين من التعليق سعة 1 ميكرولتر ، أحدهما لعد الخلايا ، والثاني لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم نقاء الخلايا الإيجابية CD31 في عينات فرز الخلايا المنشطة بعد المغناطيسية.