تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية إلى أسلاف عصبية وخلايا نجمية

ابدأ بالمجالات العصبية غير الملتصقة ، وهي مجموعة ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية العصبية البشرية في وسط مكيف مشتق من زراعة الخلايا.

يحتوي هذا الوسيط على العناصر الغذائية وعوامل النمو ومكونات المصفوفة خارج الخلية التي تحافظ على بقاء الخلية.

جهاز طرد مركزي لجمع المجالات العصبية.

عالجها بإنزيمات التربسين و DNase ، واخلط المحتويات ، ثم احتضنها.

يعطل التربسين الالتصاق من خلية إلى أخرى ويسهل انفصال الخلايا ، بينما يحلل DNase الحمض النووي الحر لمنع تكتل الخلايا.

ماصة المحتويات بشكل متكرر لتشكيل تعليق أحادي الخلية. ثم أضف مثبط التربسين لتحييد نشاط الإنزيم.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في وسط تكاثر يحتوي على عوامل النمو العصبي.

ضع معلق الخلية على غطاء مطلي بالبوليمر يوضع في صفيحة متعددة الآبار. احتضان للسماح بارتباط الخلايا الجذعية بالبوليمر.

علاوة على ذلك ، بناء على امتصاص عوامل نمو محددة ، تتمايز الخلايا الجذعية إلى أسلاف عصبية وخلايا نجمية ، وهي جاهزة لمزيد من النضج إلى أنواع خلايا متخصصة.

بعد تحضير وسط الاستزراع وطلاء الخلايا الجذعية العصبية البشرية وفقا لبروتوكول النص ، استرجع من الحاضنة قارورة الخلايا المراد تمريرها ، وأدخلها إلى خزانة السلامة الحيوية أو BSC. قم بإمالة القارورة برفق ، مما يسمح للخلايا بالغرق في قاع الوسط المجمع.

انقل 10 ملليلتر من الوسط إلى جزأين سعة 5 ملليلتر إلى أنبوب نظيف سعة 15 ملليلتر يسمى "CM" لوسط مكيف. احرص على عدم استنشاق أي من الخلايا المستقرة في القارورة. انقل 3 مل من الوسط من أنبوب CM إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يسمى "محلول مثبط التربسين". ثم ضع أنبوب CM جانبا.

بعد ذلك ، قم بإزالة 5 ملليلتر من الوسط والخلايا المتبقية في قارورة T75 ، وضعها في أنبوب نظيف سعة 15 مليلتر يسمى "خلايا". بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية وأحجام 3.5 ملليلتر من CM ، اشطف قارورة T75 مرتين ، ونقل شطف CM إلى أنبوب "الخلايا". سيؤدي ذلك إلى إزالة جميع المجالات العصبية من قارورة T75.

جهاز الطرد المركزي لأنبوب "الخلايا" عند 100 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء دوران الخلايا ، احصل على محلول الجلوكوز DPBS المعد مسبقا من حمام مائي 37 درجة مئوية ، وأضف الكمية المناسبة من التربسين و DNase.

بعد توقف أنبوب "الخلايا" عن الدوران ، قم بإزالة كل المادة الطافية المتوسطة المكيفة ، وانقله إلى أنبوب CM. أضف محلول التربسين إلى حبيبات الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلترا، واستخدم ماصة سعة 5 ملليلتر لتحريك الماصة لأعلى ولأسفل من 5 إلى 10 مرات تقريبا. أغلق غطاء الأنبوب واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

إلى أنبوب مثبط التربسين ، أضف الحجم المناسب من مثبط التربسين ، مع إضافة نفس حجم المحلول المستخدم لمحلول التربسين. ثم ضع محلول مثبط التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية لحين الحاجة.

بعد الحضانة ، قم بتحريك الماصة للخلايا لأعلى ولأسفل من 5 إلى 10 مرات. ثم احتضن العينة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة إضافية. بعد حضانة الخلية ، قم بتحريك الماصة للخلايا لأعلى ولأسفل حتى يتم فصل الكرات تماما. بعد ذلك ، أضف محلول مثبط التربسين على الفور ، وقم بتعليق الخلية لأعلى ولأسفل 10 مرات.

لحساب عدد الخلايا في المعلق ، قم بتقطيع 15 ميكرولترا من خليط التريبان الأزرق على قارب وزن صغير ، وأضف 5 ميكرولترات من تعليق الخلية. الماصة لأعلى ولأسفل من 3 إلى 5 مرات للخلط. بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولترات من معلق الخلية الزرقاء على جانبي مقياس الدم ، مغطى بغطاء زجاجي.

راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي واحسب العدد الإجمالي للخلايا في كل شبكة من شبكات الزوايا الأربع. ثم اجمع هذه الأرقام معا. بعد حساب عدد الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، أضف حجما من تعليق الخلية إلى كل قارورة T75 للحصول على 5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة.

إذا كان الحجم أقل من 5 ملليلتر ، أضف وسيطا مكيفا إضافيا يصل إلى 5 ملليلتر. ثم أضف 10 مل من وسط DFHGFPS الجديد الذي يحتوي على عوامل نمو إلى القارورة. تأكد من تسمية القارورة بنوع الخلايا والتواريخ وعدد الخلايا في القارورة ورقم المقطع. إذا رغبت في ذلك ، احتضان الخلايا في هذه المرحلة.

لألواح HNSCs الملتصقة ، في اليوم السابق للمرور ، قم بتنظيف BSC كما هو موضح في بروتوكول النص ، واستخدم الملقط لوضع غطاء زجاجي معقم واحد مقاس 12 ملم في آبار صفيحة 24 بئرا. قم بتغطية الآبار بأغطية ب 250 ميكرولتر لكل بئر بنسبة 0.01٪ Poly-D-Lysine أو PDL بماء معقم ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة PDL من الآبار ، ثم قم بتغطيتها ب 1 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من laminin DPBS.

احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إذا لم تكن هناك حاجة في اليوم التالي ، فقم بلف البارافيلم حول حواف اللوحة لإغلاقها وتخزينها عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة أي محلول لامينين زائد من الآبار من خلال الشفط ، واستخدم 0.5 مل من DPBS لشطف الآبار مرة واحدة. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في كل بئر بكثافة 0.6 إلى 1 × 10⁵ خلايا لكل سنتيمتر مربع.