توليد عضيات دماغية من النوع الأمامي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

تبدأ مع لوحة بئر منخفضة التعلق تحتوي على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان أو iPSCs في وسط الخلايا الجذعية المكملة بمثبط رو-كيناز.

تدخل المثبطات إلى الخلايا ، وتمنع إنزيمات Rho-kinase ، وتحافظ على صلاحية الخلية. هذا يعزز تشكيل مجاميع iPSC.

استبدل الوسط بوسط خلية جذعية للسماح للركام بالنمو. انقلها إلى طبق ثقافة منخفض التعلق بوسط حث قشري.

مكونات هذا الوسيط يسبب iPSCs للتمايز إلى خلايا الأديم الظاهر العصبي, السلائف العصبية.

انقل كل ركام للأديم الظاهر العصبي إلى فيلم به آبار ضحلة.

استبدل الوسط بمصفوفة غشاء قاعدية واحتضانه للسماح بتصلب المصفوفة واحتجاز الركام.

انقل هذه الركام المضمنة في المصفوفة إلى طبق يحتوي على وسط تحريض قشري واحتضانه بالتحريض.

بمرور الوقت ، تستخدم خلايا الأديم العصبي الظاهر عوامل التمايز وتتطور إلى خلايا ظهارية عصبية.

قم بتغيير الوسط إلى وسيط تمايز عضوي ، مما يسمح للخلايا بالنضوج إلى أنواع خلايا أكثر تخصصا ، وتشكيل عضوية دماغية تشبه قشرة الدماغ الأمامي.

لتوليد مجاميع الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، عندما تصل مزارع الخلايا الجذعية إلى 70٪ إلى 90٪ من التقاء ، أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا إلى بئر واحد من لوحة الثقافة المكونة من ستة آبار لفصل الخلايا.

الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، والتي تتكيف مع ظروف زراعة أحادية الطبقة ، هي نوع جيد من الخلايا لتوليد الركام لأنها أقل عرضة لموت الخلايا الناجم عن الإجهاد أثناء إجراء التفكك والتجميع.

بعد 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، اضغط برفق على الطبق ، واستخدم 2 مل من DMEM / F-12 لغسل الخلايا من قاع البئر. انقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وارفع حجم محلول الخلية إلى 10 ملليلتر مع المزيد من وسط DMEM / F-12.

بعد العد ، انقل 4.5 في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل تجمع خلية جذعية متعددة القدرات في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، مع استكمال 50 مثبط ROCK ميكرومولار لتحقيق 4.5 × 10³ خلايا لكل 150 ميكرولتر من التركيز المتوسط.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من الخلايا إلى الآبار الفردية للوحة منخفضة التوصيل على شكل حرف U ذات 96 بئرا ، وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. لمراقبة تحريض الأديم العصبي الأمامي ، استخدم مجهر زراعة الأنسجة لمراقبة التغيرات المورفولوجية لمجاميع الخلايا الجذعية متعددة القدرات عن كثب كل يوم تحت تكبير منخفض.

في اليوم الأول ، يجب مراعاة مجاميع الخلايا ذات الحدود الواضحة. في اليوم 2 ، استنشق بعناية ما يقرب من 2/3 من الوسط دون إزعاج مجاميع الخلايا في قاع كل بئر ، واستبدل الوسط المهمل ب 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية الطازجة متعددة القدرات.

بعد ما بين أربعة وستة أيام، عندما يصل قطر مجاميع الخلايا إلى 350 إلى 450 ميكرومتر وتظهر حوافا ناعمة، استخدم طرف ماصة معدل سعة 100 ميكرولتر لنقل ما يصل إلى 20 ركاما إلى صفيحة ثقافة واحدة منخفضة التعلق بطول 6 سم تحتوي على 5 ملليلتر من وسط الحث القشري.

استبدل وسط الحث القشري بوسط جديد مرة كل ثلاثة أيام ، ومراقبة مورفولوجيا الركام يوميا تحت هدف 4x. بعد أربعة إلى خمسة أيام في وسط الحث القشري ، يجب أن تبدأ حواف مجاميع الخلايا في السطوع على السطح ، مما يشير إلى تمايز الأديم الظاهر العصبي ، ويجب أن يظهر التنظيم الشعاعي للظهارة الكاذبة.

لتضمين مجاميع الأديم الظاهر العصبي في سقالة مصفوفة ، املأ مستخلص الغشاء القاعدي على الجليد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. أثناء ذوبان المستخلص ، استخدم مقصا معقما لتقطيع فيلم البارافين البلاستيكي إلى مربع واحد 4 × 4 سنتيمترات لكل 16 عضوا ، وضع كل قطعة من الفيلم فوق صينية طرف ماصة دقيقة فارغة سعة 100 ميكرولتر.

اضغط على فيلم البارافين بطرف إصبع مرتديا قفازا حتى تظهر غمازات صغيرة ، ونظف الفيلم بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية في خزانة مغلقة ومعقمة للسلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة ، استخدم طرف ماصة معدل سعة 100 ميكرولتر مع فتحة من 1 و 1/2 إلى 2 ملم لنقل كل ركام خلية إلى غمازة واحدة في الفيلم.

عندما يتم نقل جميع الركام، استخدم طرف ماصة غير مقطوع سعة 100 ميكرولتر لشفط الوسط بعناية من كل غمازة، وأضف 40 ميكرولترا من مستخلص الغشاء القاعدي غير المخفف إلى كل مجموعة خلية.

احرص على عدم إتلاف العضيات عن طريق التلاعب الخشن أو الشفط في طرف الماصة ، لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الظهارة العصبية النامية.

استخدم طرف الماصة لوضع الركام في منتصف كل قطرة، واستخدم ملقطا معقما لنقل لوح فيلم البارافين البلاستيكي بعناية إلى طبق بتري بطول 10 سم. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

أثناء تصلب المستخلص ، أضف 5 ملليلتر من وسط الحث القشري الطازج إلى طبق ثقافة منخفض التعلق يبلغ طوله ستة سنتيمترات. في نهاية الحضانة ، اقلب ورقة فيلم البارافين ، واستخدم ملقطا معقما للضغط برفق على ما يصل إلى 16 قطرة مبلمرة في كل طبق طوله 6 سم. ثم أعد الركام إلى حاضنة زراعة الخلايا.

في اليوم التالي ، انقل أطباق الثقافة العضوية إلى شاكر ثقافة الخلايا الهزاز المائل بزاوية 5 درجات عند 14 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الخلايا مع مراقبة المجهر الضوئي اليومي حتى تصل الركام إلى مرحلة التمايز ذات الاهتمام.