عزل الخلايا الدبقية المعوية من تحت الغشاء المخاطي والصفيحة المخصوصة للفأر

خذ جزءا من الأمعاء الدقيقة للفأر تم تجريده سابقا من العضلة الطولية والضفيرة العضلية المعوية ، والطبقات التي تحتوي على الخلايا العصبية المعوية ، والخلايا الدبقية.

اقطع المنديل وضعه في مخزن مؤقت يحتوي على EDTA. احتضان مع الهزاز.

يعطل EDTA تقاطعات الخلايا الخلوية ، ويفصل الغشاء المخاطي الظهاري عن الصفيحة المخصوصة الأساسية وتحت الغشاء المخاطي ، وهي طبقات النسيج الضام التي تحتوي على الخلايا الدبقية المعوية.

الماصة مرارا وتكرارا لإخراج الخلايا الظهارية.

قم بالتصفية من خلال مصفاة الخلية وتخلص من التدفق.

انقل الأنسجة إلى مخزن مؤقت للتفكك غير الأنزيمي واحتضانه بالهزاز. يعمل المخزن المؤقت للتفكك على إرخاء الصفيحة المخصوصة والمصفوفة خارج الخلية تحت المخاطية ، مما يؤدي إلى فصل الخلايا.

الماصة مرارا وتكرارا لفصل الخلايا بشكل أكبر.

قم بالتصفية من خلال مصفاة الخلية لجمع الخلايا.

جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

خذ آبارا مغلفة بالبروتين الالتصاق تحتوي على وسط نمو دبقي وقم بلوحة الخلايا.

يسهل الطلاء التصاق الخلايا ، بينما تعزز عوامل النمو بشكل انتقائي تكاثر الخلايا الدبقية ، مما يؤدي إلى إنشاء صفيحة خاصة وثقافة الخلايا الدبقية تحت المخاطية.

لإزالة الغشاء المخاطي الظهاري ، استخدم أولا مقصا دقيقا لتقطيع الأمعاء إلى قطع يبلغ طولها حوالي 0.5 سم وجمع القطع في 30 مل من محلول EDTA / HEPES / DPBS المثلج. هز المحلول المحتوي على الأنسجة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق بحوالي 60 إمالة في الدقيقة.

قم بترطيب ماصة بلاستيكية سعة 5 ملليلتر مسبقا عن طريق سحب المخزن المؤقت EDTA/HEPES/DPBS لأعلى ولأسفل مرة واحدة، ثم استخدم الماصة المبللة مسبقا لترطيب الأنسجة وتعليق المخزن المؤقت 20 مرة لإخراج الغشاء المخاطي الظهاري.

اجمع الأنسجة عن طريق صب الخليط من خلال مصفاة خلايا نايلون 100 ميكرون ، واستخدم ملقط الإبرة لوضع الأنسجة المحتجزة في المصفاة في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من EDTA / HEPES / DPBS المثلج. كرر حضانة EDTA / HEPES / DPBS مرة ثانية عن طريق هز الأنسجة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق بحوالي 60 إمالة في الدقيقة لتجريد الغشاء المخاطي الظهاري الإضافي.

قم بإجراء عملية ترتيتورية لطيفة باستخدام ماصة 5 ملليلتر مبللة مسبقا. تميل الأنسجة إلى الالتصاق بداخل الماصة مع إزالة المزيد من الظهارة.

مطلوب التجربة اللطيفة في هذه المرحلة ، لأن الخلايا الدبقية المعوية أكثر هشاشة.

اجمع الأنسجة بعد الحضانة الثانية عن طريق صب الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرون ، وتخلص من التدفق من خلالها. يجب أن يكون التدفق الثاني أقل تعكرا بشكل ملحوظ من الأول. كرر حضانات EDTA لمدة 10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا تقريبا.

انقل الأنسجة من مصفاة النايلون إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 ملليلتر من محلول استعادة الخلايا المتاح تجاريا. ثم صخري لمدة 25 إلى 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بترتيورث برفق 10 مرات لفصل الخلايا الدبقية المعوية عن الصفيحة المخصوصة ، ثم قم بالتصفية من خلال مرشح 40 ميكرون وجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل.

اشطف المنديل الموجود على مرشح النايلون ب 1 مليلتر من DPBS. تخلص من الأنسجة وانقل 5 إلى 6 ملليلتر من المرشح إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي نظيف سعة 15 ملليلترا. قم بتدوير المرشح عند 2,000 مرة جم في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية.

أعد تعليق الحبيبات المحتوية على الخلايا الدبقية في 1 ملليلتر على الأقل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف الماصة سعة 500 ميكرولتر دون إدخال فقاعات. أخيرا ، قم بطلاء الخلايا الدبقية المعوية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة 6 آبار مطلية بالصفيحة أو 100 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا تحتوي على وسائط نمو دبقية.