طريقة لعزل وحدات الأوعية الدموية العصبية عن دماغ الفئران

ابدأ بمدافع الهاون الزجاجية الباردة التي تحتوي على أنسجة دماغية قشرية للفئران ، وهي الطبقة الخارجية في الدماغ.

أضف عازلة للأوعية الدقيقة في الدماغ أو BMB ، تحتوي على مثبطات البروتياز.

الآن ، حرك المدقة لأعلى ولأسفل لفصل الأنسجة.

يطلق هذا التحريض وحدات الأوعية الدموية العصبية ، أو NVUs ، التي تتكون من الأوعية الدقيقة والخلايا المحيطة والخلايا العصبية والخلايا الدبقية. تمنع مثبطات الإنزيم البروتياز التي تم إطلاقها ، مما يحمي الأوعية الدقيقة.

انقل هذا الخليط إلى أنبوب.

أضف محلول عديد السكاريد الكثيف. استخدم دوامة لخلط المحلول مع المحتويات الأخرى بشكل موحد.

الطرد المركزي. تسمح السكريات الكثيفة بترسيب NVUs ، وهي أكثر كثافة من بقايا الأنسجة.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق NVUs في BMB الذي يحتوي على مثبط البروتياز ومحلول عديد السكاريد.

استخدم الدوامة لخلط المحتويات.

كرر عملية الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية لإزالة أي بقايا من الحطام.

قم بتعليق NVUs في BMB وتخزينها لمزيد من التحليل.

ضع أنسجة المخ القشرية في هاون زجاجي مبرد. ثم أضف 5 مل من BMB مع كوكتيل مثبط البروتياز. باستخدام الخالط الكهربائي العلوي ، أدخل مدقة في الملاط وقم بتجانس أنسجة المخ باستخدام 15 ضربة لأعلى ولأسفل عند 3,700 دورة في الدقيقة. ثم صب الجانس في أنابيب الطرد المركزي المسماة. بين العينات ، استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف المدقة.

لإجراء الطرد المركزي ، أضف 8.0 مل من محلول ديكستران بنسبة 26٪ إلى كل أنبوب طرد مركزي مصنف يحتوي على تجانس الدماغ. اقلب الأنبوب مرتين ثم قم بتدوير العينة جيدا. قم بإجراء دوامة كل عينة باستخدام زوايا متعددة لضمان خلط شامل لمحلول تجانس الدماغ مع محلول ديكستران بنسبة 26٪. الطرد المركزي للعينات عند 5,000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5.0 مل من BMB مع كوكتيل مثبط البروتين. ثم, دوامة الحبيبات لضمان الخلط الشامل. بعد ذلك ، أضف 8.0 مل من 26٪ ديكستران إلى كل أنبوب ودوامة للطرد المركزي كما هو موضح للتو. ثم ، قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى.

باستخدام قارورة مفرغة وماصة زجاجية ، قم بشفط المادة الطافية وتأكد من عدم تعطل الحبيبات التي تحتوي على وعاء الدماغ. أعد تعليق الحبيبات في BMB باستخدام مثبط الإنزيم البروتيني ثم 26٪ ديكستران مرتين أخريين. بعد الطرد المركزي النهائي ، أضف 5.0 مل من BMB إلى كل بيليه ودوامة لإعادة تعليق العينة.