تقنية لحصاد وفصل العقد الجذرية الظهرية للثقافات العصبية

خذ جزءا من العمود الفقري للفأر وقسمه لإزالة الحبل الشوكي.

افصل العقد الجذرية الظهرية ، أو DRGs ، وهي مجموعة من الخلايا العصبية محاطة بالخلايا الدبقية الساتلية ، أو SGCs.

ضع DRGs في وسط النمو. قم بإزالة جذور الأعصاب لتقليل تلوث SGC.

عالج بالكولاجيناز لتحلل مصفوفة الأنسجة وغسلها لإزالة الإنزيمات.

إدخال التربسين لتعطيل الاتصالات بين الخلايا. أضف مصلا يحتوي على بروتينات تعطل التربسين.

أضف وسط النمو وفصل الأنسجة ميكانيكيا. قم بتصفية المعلق لعزل الخلايا المفردة وأجهزة الطرد المركزي لإزالة بقايا الأنسجة.

أعد تعليق الخلايا لوضعها على وسط تدرج الكثافة ، وجهاز طرد مركزي.

تستقر الخلايا العصبية ذات الكثافة الأعلى في القاع ، مما يسهل فصل SGCs.

أعد تعليق الخلايا العصبية في وسط الثقافة. انقلها إلى بئر مزرعة مطلية بالركيزة ، مما يسمح بربط الخلية.

مكمل مع عوامل نمو الأعصاب لبقاء الخلايا العصبية.

للحصول على الخلايا العصبية DRG بعد حصاد الحبل الشوكي ، ابدأ بإزالة أي أجزاء ظهرية ثم استخدم مقصا جراحيا معقما وحادا لتقسيم العمود الفقري إلى نصفين على طول المحور الطولي ، مما يؤدي إلى تعريض أنسجة الحبل. قم بقطع العمود الفقري إلى جزأين أصغر تحت مستوى القفص الصدري ، ثم استخدم ملقطا دقيقا لإزالة جميع أنسجة الحبل السري برفق ، مع الحرص على عدم سحب وإزالة جذور DRG ، والتي تظهر على شكل خيوط بيضاء تخرج مباشرة من القنوات.

بمجرد إزالة كل الأنسجة الأساسية ، استخدم ملقطا دقيقا جدا لسحب جذر DRG بالكامل ، والوصول إلى عمق القنوات الفقرية والحرص على عدم إتلاف جذور العقد. ضع DRG في طبق بتري مساحته 60 ملم مربع يحتوي على 3 إلى 4 ملليلتر من وسط Ham's F-12 ، مع استكمال المضادات الحيوية. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقطا معقما ومشرطا لإزالة أي جذور عصبية زائدة تحيط بالعقد لتقليل تلوث الخلايا الساتلية.

بعد ذلك ، انقل DRG إلى طبق بتري بحجم 35 ملم مربع يحتوي على 1.8 مل من وسط F-12 الطازج ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجيناز من النوع 4. احتضن DRG لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بشفط الوسط بعناية باستخدام ماصة زجاجية ، مع الحرص على عدم شفط DRG أو إتلافه.

كرر خطوة الكولاجيناز واغسل DRG بوسيط F-12. بعد الغسيل الثاني ، أضف 1.8 مل من وسط F12 و 200 ميكرولتر من التربسين إلى الخلايا ، وقم بإزالة التربسين وإضافة 1 مليلتر من الوسط المكمل ب 500 ميكرولتر من FBS لإيقاف التفاعل الأنزيمي. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط وغسل DRG برفق باستخدام F-12 medium ثلاث مرات لإزالة جميع آثار المصل.

الآن ، قم بتغذية الخلايا ب 2 مل من وسط F-12 الطازج واستخدم ماصة زجاجية لنقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب سعة 15 مل. الماصة لأعلى ولأسفل من 8 إلى 10 مرات لفصل الخلايا العصبية برفق, ثم السماح للحبيبات بالتراكم في الجزء السفلي من الأنبوب. عندما تتم تسوية الحبيبات ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأضف 2 مل من وسط F12 الطازج إلى الحبيبات ، مع تكرار التفكك الميكانيكي والنقل المتوسط حتى يصبح التعليق متجانسا.

بعد ذلك ، قم بترتيورث معلق الخلية ثلاث إلى أربع مرات ، متبوعا بترشيح التعليق المتجانس الناتج من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مل. الطرد المركزي للخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلترا. أثناء دورانها ، قم ببطء بإعداد ألبومين مصل البقر المحضر حديثا بنسبة 15٪ أسفل داخل أنبوب سعة 15 مليلتر مثبت بزاوية 45 درجة لإنشاء مسار بروتين تدريجي باستخدام الأرقام الموجودة على الأنبوب كمرجع لمسار التشكيل.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية من الخلايا ، وتوفير آخر 500 ميكرولتر لإعادة تعليق الحبيبات ، وقم بتوزيع الخلايا ببطء على طول مسار البروتين في الأنبوب الجديد. بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من وسط BS المعدل وقم بزرع الخلايا في حجم صغير من الوسط في صفيحة 24 بئرا لمدة ساعتين. عندما تعلق الخلايا ، أضف وسط BS طازجا مكملا ب 50 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نمو الأعصاب.