عزل واستزراع الخلايا العضاقية للفأر

أضف عازلة إلى أنسجة دماغ الفأر وتجانسها لتحرير الخلايا والأوعية الدقيقة.

بعد ذلك ، أضف محلول BSA-dextran إلى المتجانس. امزج وجهاز طرد مركزي لفصل المكونات. تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الأوعية الدقيقة في المخزن المؤقت ، وقم بتمريرها عبر مرشح ، وقم بإزالة الأوعية الكبيرة.

الآن ، قم بالطرد المركزي للمرشح وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الأوعية الدقيقة في المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحمض النووي.

أضف الإنزيمات المحللة للبروتين لإطلاق الخلايا البطانية والفطرات المحيطية.

DNتتحلل DNA.

أضف المخزن المؤقت الذي يحتوي على BSA لإيقاف نشاط الإنزيم. جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في الوسائط وقم بوضعها على صفيحة متعددة الآبار مطلية بمصفوفة الطابق السفلي. احتضان وتعزيز التصاق الخلايا.

قم بتغيير الوسائط بانتظام.

تشكل الخلايا البطانية طبقة أحادية وتدعم نمو السعي.

يعزز مرور الخلايا اللاحق في وسط الحمض على صفيحة متعددة الآبار المطلية بالجيلاتين نمو الخلايا المحيطية مع القضاء على الخلايا البطانية.

ابدأ بوضع الدماغ من فأر ذكر C57 Black 6 الخالي من مسببات الأمراض يبلغ من العمر أربعة إلى ستة أسابيع على منديل معقم وجاف وخالي من النسالة واستخدام ملقط طرف منحني لإزالة الأعصاب المخيخية والمخطط والأعصاب القذالية. استخدم قطعة قطن لإزالة جميع السحايا المرئية ، واقلب أنسجة المخ رأسا على عقب. افتح الفصوص بضربات خارجية خفيفة وقم بإزالة جميع الأوعية الدموية المرئية. بعد ذلك ، ضع أنسجة المخ الخالية من السحايا في طبق بتري بحجم 100 ملم يحتوي على 15 مل من عازلة الغسيل الباردة B.

لتجانس الأنسجة ، انقل عينة الدماغ إلى أنبوب هاون Dounce Tissue Grinder ، وأضف 3 إلى 4 ملليلتر من Washing Buffer B إلى الأنبوب. استخدم مدقة فضفاضة لفرم الأنسجة 55 مرة. بعد ذلك ، اشطف المدقة باستخدام Washing Buffer B ، وافرم ملاط المناديل بمدقة ضيقة 25 مرة. في نهاية التجانس ، قم بتقسيم الملاط بالتساوي بين أنبوبين سعة 50 مليلتر وأضف 1.5 ضعف حجم ألبومين مصل الأبقار البارد بنسبة 30٪. ثم هز الأنابيب بقوة لخلط الملاط.

لعزل جزء الأوعية الدموية ، قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، ونقل المواد الطافية إلى أنبوبين جديدين. قم بتخزين الحبيبات في Washing Buffer B على الثلج. أعد تعليق الكريات في ثلاثة ملليلتر من عازلة الغسيل الباردة B على الجليد.

الطرد المركزي للطافية المحصودة ، وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. تخلص من المواد الطافية ، وأعد تعليق الكريات في 3 ملليلتر من Washing Buffer B. بعد ذلك ، قم بتجميع الكريات المعلقة وقم بتجميع الحجم النهائي لمعلقات الخلية المجمعة إلى 10 ملليلتر باستخدام عازلة الغسيل الباردة الطازجة B.

علاوة على ذلك ، قم بفصل الخلايا بماصة 10 ملم ست مرات حتى لا تظهر أي كتل متبقية من الكريات ، واستخدم مجموعة مرشح فراغ ومصفاة شبكية من النايلون لتصفية تعليق الخلية. ضع المصفاة في طبق بتري ، وقم بتنظيف الشبكة باستخدام Wash Buffer B الطازج والكشط لاستعادة أي شعيرات دموية. ثم قم بإجراء ترشيح ثان باستخدام مرشح جديد.

قسم المرشح بالتساوي بين أنبوبين واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المواد الطافية ، قم بتجميع الكريات في أنبوب واحد يحتوي على عازلة الغسيل B الدافئة مسبقا مع الإنزيمات وأضف الكولاجيناز المسخن مسبقا إلى الأنبوب. ضع الأنبوب في حمام مائي مهتز لمدة 33 دقيقة بدقة عند 37 درجة مئوية قبل إيقاف التفاعل باستخدام 30 مل من محلول الغسيل البارد B.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وتخلص بعناية من المادة الطافية. قم بإعادة تعليق الحبيبات بسرعة ولكن بعناية في Washing Buffer B ست مرات وقم بالطرد المركزي للتعليق مرة أخرى. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من وسط DMEM الكامل وبذرة 2 مل من تعليق الخلية في DMEM الكامل في تسعة آبار من ثلاث ألواح من ستة آبار مطلية ب Matrigel.

ضع مزارع الخلايا في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية ، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة قبل إزالة الحطام بعناية من كل بئر ، وأضف وسائط DMEM جديدة. بعد 48 ساعة ، قم بتغيير الوسط في كل بئر كل 48 ساعة. في اليوم من 8 إلى 10 ، عندما تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 100٪ ، قم بتمرير الخلايا في وسط زراعة الطفيليات إلى صفائح جديدة من ستة آبار مغطاة بالجيلاتين وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 6 إلى 7 أيام إضافية مع المراقبة.