$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ابدأ بدماغ الفئران مع الخلايا العصبية وغير العصبية والمناعية داخل مصفوفة الدماغ خارج الخلية أو ECM.
افرم الأنسجة وأعد تعليقها في وسط ثقافة.
انقل شظايا الأنسجة هذه إلى أنبوب ومعالجتها بإنزيمات الكولاجيناز و DNase-I.
يهضم الكولاجيناز ECM ، ويطلق الخلايا الفردية ، بينما يحلل DNase-I الحمض النووي الحر لمنع تكتل الخلايا.
ثم أضف EDTA لتعطيل إنزيمات الكولاجيناز.
أضف وسيطا ثقافيا. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.
أضف محلول تدرج الكثافة ووسط الثقافة إلى حبيبات الخلية ، مما يؤدي إلى إنشاء طبقة متدرجة منخفضة الكثافة.
امزج المحلول ثم قم بتسطيله بمحلول تدرج عالي الكثافة لإنشاء فرق في الكثافة.
جهاز طرد مركزي بسرعة منخفضة لفصل الخلايا المناعية في الواجهة ، مع وجود بقايا خلية أخف وزنا في الأعلى وخلايا عصبية ودبقية أثقل في الأسفل.
قم بإزالة الطبقة العليا ، وجمع الخلايا المناعية ، ونقلها إلى أنبوب آخر.
جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في وسط ، وتشكيل تعليق أحادي الخلية للتطبيقات النهائية.
صب أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي مع الوسائط في طبق بتري 100 ملم ، واستخدم الملقط لنقل الأنسجة إلى الأسفل. افرم أنسجة المخ بشفرة حلاقة معقمة ، واجمع الأنسجة في الجزء السفلي من اللوحة. أضف 3 ملليلتر من RPMI مكملا بنسبة 10٪ FCS إلى طبق بتري ، ثم استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإعادة تعليق الأنسجة في الوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.
أضف الكولاجيناز من النوع الأول و DNase I إلى الأنسجة واحتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. اقلب الأنابيب كل 15 دقيقة لخلط الأنسجة جيدا مع الإنزيمات. بعد الحضانة ، أضف EDTA إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.01 مولار ، واحتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق إضافية لتعطيل الكولاجيناز.
أضف 9 مل من RPMI ، مكملا بنسبة 10٪ FCS لكل أنبوب ، ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 450 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخدم ماصة باستور مع فراغ لشفط المادة الطافية ، مع الحرص على عدم لمس حبيبات الخلية.
أضف 3 ملليلتر من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS إضافية لرفع الحجم النهائي إلى 10 ملليلتر وإعادة تعليق حبيبات الخلية. اقلب الأنبوب واخلطه جيدا. بعد ذلك، أدخل ماصة مصلية تحتوي على 1 مليلتر من محلول تدرج متساوي التوتر بنسبة 70٪ في قاع الأنبوب.
ضع
الأساس ببطء للحل ، مع الحرص على عدم صنع الفقاعات. قم بإزالة الماصة المصلية من الأنبوب، مع التأكد من عدم إزعاج التدرج. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 800 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم استنشق المادة الطافية ، بما في ذلك طبقة حطام المايلين حتى تبقى 2 إلى 3 ملليلتر في الأنبوب.
استخدم ماصة سعة 1 مليلتر لحصاد طبقة الخلية بين تدرج الكثافة 30٪ و70٪ ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. أضف وسائط RPMI 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 15 مليلترا ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.