عزل خلايا شوان عن جذور العمود الفقري للفأر

خذ جذرا عصبيا وقطعه إلى قطع صغيرة.

انقله إلى أنبوب يحتوي على إنزيم هضمي واحتضانه.

يهضم الإنزيم المصفوفة خارج الخلية.

أضف وسائط تحتوي على مصل لوقف الهضم.

قم بضرب المحتوى بشكل متكرر ، ثم قم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات.

مرر المعلق عبر مصفاة لإزالة الأنسجة غير المهضومة. احتضان الخلايا التي تم جمعها في طبق.

تلتصق الخلايا الليفية وخلايا شوان أو SCs بالصفيحة وتنقسم.

قم بإزالة الخلايا غير المرفقة. اغسل الخلايا المرفقة بمخزن مؤقت للفوسفات.

أضف الإنزيمات الهاضمة لتفكيك الجلدسات الجلدية الحساسة للهضم. أوقف الهضم باستخدام الوسائط.

افصل SCs تماما عن طريق إضافة الوسائط.

نقل الخلايا إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الوسائط الخاصة ب SC.

انقل الخلايا إلى صفيحة غير مطلية واحتضنها.

سوف تلتصق أي الخلايا الليفية المتبقية ، مما يترك SCs معلقة.

انقل التعليق إلى لوحة مطلية بالمصفوفة.

احتضان لتعلق خلية شوان وانقسامها.

قم بتقطيع الأعصاب إلى قطع من 3 إلى 5 ملم بالمقص. أضف 1 مليلتر من 0.25٪ تربسين ، وانقل القطع العصبية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 5 ملليلتر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك ، لوقف الهضم ، أضف 3 إلى 4 ملليلتر من DMEM الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين. قم بعرض الخليط لأعلى ولأسفل برفق ، حوالي 10 مرات. جهاز طرد مركزي بمعدل 800 مرة جم لمدة 5 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الراسب في 2 إلى 3 ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 400 شبكة ، ثم استخدم التعليق لتلقيح طبق بتري 60 ملم. احتضان أطباق بتري لمدة 4 إلى 5 أيام عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تصل المزرعة إلى 90٪ من التقاء ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1X PBS. ثم ، لهضم خلايا شوان ، أضف 1 مليلتر من 0.25٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية لكل طبق 60 ملم. بعد 8 إلى 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة ، أوقف عملية الهضم بإضافة 3 ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. لفصل خلايا شوان ، انفخ برفق على الخلايا باستخدام ماصة.

تحقق بالمجهر من انفصال الخلايا. بعد ذلك ، اجمع الوسط الذي يحتوي على خلايا شوان وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الراسب في 3 ملليلتر من المتوسط. استخدم المعلق لتلقيح أطباق بتري غير المشفرة مقاس 60 ملم ، واحتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. انقل الوسط ، الذي سيحتوي على خلايا شوان إلى طبق متوسط مغطى ب poly-L-lysine ، واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.