تقنية لعزل النوى من الخلايا غير العصبية في التلفيف المسنن في الحصين

خذ التلفيف المسنن من دماغ الفأر في مخزن مؤقت للتجانس البارد.

ينفصل ميكانيكيا لإطلاق الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والخلايا الجذعية.

يتخلل المنظف المعتدل للمخزن المؤقت الخلايا ، ويطلق النوى والعضيات الأخرى.

قم بتصفية المتجانس لإزالة بقايا الأنسجة. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي ، وإزالة العضيات ، وإعادة التعليق في مخزن التجانس لتحلل أي خلايا سليمة.

جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على عضيات تم إطلاقها ، وأعد تعليق النوى في مخزن مؤقت للغسيل.

قم بالفلتر لإزالة أي حطام وأجهزة طرد مركزي وإزالة المادة الطافية.

أدخل صبغة الحمض النووي الفلورية لتسمية جميع النوى والجسم المضاد المترافق بالفلوروفور الذي يرتبط بالمستضد النووي العصبي ، أو NeuN ، مع تسمية نوى الخلايا العصبية.

باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلورة ، حدد الركام ذات كثافة مضان صبغة الحمض النووي الأعلى وخصائص تشتت أعلى ، وفصل النوى المفردة.

تحليل النوى المفردة ، وفصل النوى العصبية الإيجابية NeuN وعزل النوى السالبة NeuN التي تنتمي إلى الخلايا الدبقية والخلايا الجذعية.

قم بتجانس الأنسجة ب 10 ضربات من المدقة A السائبة ، متبوعة ب 15 ضربة من المدقة B الضيقة. انقل الجانس إلى أنبوب 15 ملليلتر مبرد مسبقا. اشطف الخالط Dounce ب 1 مليلتر من HB البارد ، وامزجه مع نفس الأنبوب.

أضف 3 ملليلتر من HB إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، واحتضنه لمدة 5 دقائق على الثلج. امزج تعليق النوى مرتين عن طريق قلب الأنبوب برفق. باستخدام 0.5 مل من HB ، قم بترطيب غطاء المصفاة 70 ميكرومتر مسبقا الموضوع فوق أنبوب اختبار سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق النوى قبل غسل مصفاة الخلية ب 0.5 مل من HB.

بعد ذلك ، قم بإزالة مصفاة الخلية ، وقم بالطرد المركزي لأنبوب الاختبار في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 500 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات برفق في 4 ملليلتر من HB باستخدام ماصة P1000.

بعد خمس دقائق من الحضانة على الجليد ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 ملليلتر من وسائط الغسيل. استخدم 0.5 مل من وسائط الغسيل لترطيب غطاء مصفاة 35 ميكرومتر مسبقا فوق أنبوب اختبار سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق النوى عن طريق سحب 0.5 مل من التعليق في المرة الواحدة باستخدام ماصة P1000.

بعد غسل غطاء المصفاة ب 0.5 مل من وسائط الغسيل ، ضع الأنبوب على الثلج. انقل المرشح إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر ، وقم بطرده المركزي لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية عند 500 جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من وسائط الغسيل.

كرر الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من وسائط الغسيل باستخدام الجسم المضاد المترافق للفأر المضاد للنيو و AlexaFlour488 و 1 ميكروغرام لكل مليلتر DAPI. احتضن التفاعل لمدة 45 دقيقة على الجليد في الظلام.

بالنسبة لفرز النوى المنشطة بالفلورة أو FANS ، انقل تعليق النوى الملطخة بالمناعة إلى أنبوب اختبار سعة 5 ملليلتر ، وضعه على الجليد حتى بدء إجراء قياس التدفق الخلوي.

قم

بتدوير العينات لمدة ثلاث ثوان بكثافة خفيفة قبل وضع الأنابيب في أداة FACS.

للحصول على البيانات من تعليق نوى البقعة ، اضبط البوابات في ارتفاع DAPI ومنطقة DAPI لاستبعاد بقايا الخلية والنوى المجمعة. بعد ذلك ، قم بتعيين البوابات في منطقة التشتت الجانبي أو SSC ومنطقة التشتت الأمامي أو FSC لفصل النوى المفردة عن الركام المتبقي أو حطام الخلية الملون ب DAPI.

بعد ذلك ، قم بعزل السكان سالبين NeuNAF488 عن طريق ضبط البوابات لمنطقة NeuNAF488 و FSC.

بعد التحليل ، قم بفرز السكان المضادين ل NeuNAF488 في أنبوب تجميع سعة 1.5 مليلتر مملوء ب 50 ميكرولترا من وسائط الغسيل باستخدام استراتيجية البوابات.