إعادة برمجة مصير الخلية للخلايا الجرثومية للديدان الخيطية إلى خلايا عصبية

خذ البكتيريا المعدلة وراثيا على وسط نمو الديدان الخيطية.

تحمل البكتيريا بلازميد مع جين عامل تنظيم الكرومات الخيطية.

يحتوي الوسيط على محفز يحفز التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا من الجينوم البكتيري الذي ينسخ جين العامل المنظم للكروماتين إلى dsRNA.

أضف يرقات الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التي تحمل جين عامل النسخ المحفز لمصير الخلايا العصبية تحت محفز الصدمة الحرارية.

عند استهلاك البكتيريا ، يولد dsRNA الذي يتم تناوله siRNA يقلل من تنظيم التعبير عن عامل تنظيم الكروماتين ، مما يسهل إعادة برمجة مصير الخلية.

من خلال الخلايا الجرثومية للوالدين ، يتم تمرير siRNA إلى النسل.

يسمح تقليل تنظيم التعبير عن العامل المنظم للكروماتين في الخلايا الجرثومية للذرية ، المشار إليه بالنمط الظاهري للفرج البارز ، بإعادة برمجتها.

ضع صدمة حرارية على النسل ، وقم بتنشيط محفز الصدمة الحرارية والتعبير عن عامل النسخ المحفز لمصير الخلايا العصبية الذي يؤدي إلى التمايز العصبي ، وتحويل الخلايا الجرثومية إلى خلايا عصبية.

تعبر الخلايا العصبية عن بروتين مراسل الفلورسنت المعدل وراثيا ، مما يسهل التصور المجهري.

انقل يدويا 50 ديدان L4 لكل تكرار إلى لوحة NGM RNAi. استخدم سلكا بلاتينيا. يمكن التعرف على ديدان L4 بواسطة بقعة بيضاء في منتصف الطريق تقريبا على طول جوانبها البطنية. الآن ، احتضن الديدان عند 15 درجة مئوية في الظلام لمدة سبعة أيام تقريبا. IPTG حساس للضوء.

عندما يصل ذرية F1 إلى مرحلتي L3 و L4 ، افصلها عن الأبوية الأكبر والأكثر سمكا. في هذه المرحلة ، قم بفحص F1 بحثا عن النمط الظاهري للفرج البارز ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي ضد lin-53 كان ناجحا. يمكن أن يؤدي نشاط الحمض النووي الريبي أيضا إلى الفتك ، والتي تزيد عن 15 درجة مئوية. لتنشيط G1 وتحفيز الخلية الجرثومية على تحويل الخلايا العصبية في ذرية F1 ، صدم الديدان بالحرارة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. استخدم حاضنة تهوية ، لأنها تسمح بصدمة حرارية أكثر كفاءة.

بعد الصدمة الحرارية ، احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية طوال الليل في الظلام. من المهم تجنب إحداث الإفراط في التعبير عن Q1 عن طريق الصدمة الحرارية قبل أن تصل إلى منتصف مرحلة L3. يمكن أن يؤدي ذلك إلى التعبير عن بروتين Q1 في الأنسجة غير المستهدفة. في اليوم التالي ، قم بإعداد مصدر ضوء مضان ومرشح GFP لفحص بحثا عن التألق المشتق من الجينات المعدلة وراثيا في منطقة منتصف الجسم.