عزل مجموعات الخلايا عن أنسجة المخ باستخدام فرز النوى المنشط بالفلورة

انقل قطعة من أنسجة المخ البشري المجمدة الطازجة إلى مطحنة مناسبة تحتوي على عازلة للتحلل البارد.

حرك المدقة لأعلى ولأسفل لكسر الأنسجة ميكانيكيا ، وإطلاق الخلايا.

تكسر جزيئات المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت للتحلل غشاء الخلية ، وتطلق النوى.

انقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي مناسب وأضف عازلة السكروز الباردة إلى قاع الأنبوب ، مما يخلق تدرجا في الكثافة.

جهاز طرد مركزي بسرعة عالية لفصل النوى في قاع الأنبوب.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق النوى في محلول ملحي مخزن.

أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور الخاصة بالهدف إلى النوى واحتضانها للسماح للجسم المضاد بالارتباط بالبروتين النووي المستهدف.

أضف صبغة تلطيخ نووية لتصور الحمض النووي السليم.

قم بإجراء فرز النوى التي يتم تنشيطها بالفلورة لفرز نوى مجموعات الخلايا المختلفة بناء على إشارات مضان مميزة.

ابدأ في تشريح ما يقرب من 200 إلى 400 ملليغرام من الأنسجة من عينة من أنسجة قشرة القشرة البشرية البالغة الطازجة والمجمدة. ضع الأنسجة في منديل زجاجي سعة 7 ملليلتر يحتوي على 4 ملليلتر من محلول التحلل المثلج البارد على الثلج ، وطحن الأنسجة حوالي 50 مرة.

انقل الجانس إلى أنبوب بولي بروبيلين فائق الطرد المركزي سعة 12 ملليلتر. استخدم ماصة سعة 5 ملليلتر لإضافة 6.5 مل من السكروز البارد إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق دون إزعاج الواجهة بين السكروز وتجانس الأنسجة.

لجمع النوى ، قم بالطرد المركزي الفائق للمحللات لمدة ساعة واحدة عند 101،814 مرة جم ، وشفط المادة الطافية والحطام بعناية دون إزعاج الحبيبات. أضف PBS إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق ، مع تعليق حبيبات النوى.

للفرز المنشط بالفلورة للنوى المعزولة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولترا من العينة المعلقة إلى محلول جسم مضاد يحتوي على الجسم المضاد للفأر المترافق AlexaFlour555. أضف ما يقرب من 20 ميكرولترا من العينة المعلقة إلى محلول الجسم المضاد يحتوي على الجسم المضاد للفأر المترافق APC المضاد ل PAX6. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز محمي من الضوء ، أضف DAPI بنسبة 1 إلى 1,000 إلى جميع العينات والضوابط.