الحصول على مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية من الحصين الفئران

خذ شظايا الحصين الفئران.

احتضان مع غراء لهضم المصفوفة خارج الخلية للأنسجة وفك الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة.

أضف DNase واخلط.

قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصات بأقطار متناقصة تدريجيا للحصول على معلق أحادي الخلية. احتضان DNase لتحلل الحمض النووي الملوث.

مرر التعليق من خلال مصفاة ، وإزالة الحطام.

أضف المخزن المؤقت الذي يحتوي على أيونات ثنائية التكافؤ لإيقاف النشاط الأنزيمي.

جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية الغنية بالإنزيم.

الآن ، أضف حبات مغناطيسية عازلة ومضادة للمايلين. احتضان للحبات لربط حطام المايلين.

بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخليط في المخزن المؤقت وقم بتحميله على عمود فصل مغناطيسي يحتوي على كرات مغناطيسية حديدية موضوعة في المجال المغناطيسي للفارز المغناطيسي.

يحتفظ المجال المغناطيسي بحطام المايلين المرتبط بالخرزة المغناطيسية في العمود بينما تمر الخلايا الخالية من المايلين.

اغسل العمود بالمخزن المؤقت واجمع التدفق الذي يحتوي على الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة.

ابدأ التفكك العصبي باستخدام شفرات حلاقة معقمة لتقطيع كل عينة يتم حصادها من أنسجة المخ البالغة إلى قطع صغيرة من 30 إلى 400 ملليغرام على غطاء صفيحة استزراع من ستة آبار. ثم اغمر الأنسجة في 1 ملليلتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ، واستخدم ماصة لنقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 2 ملليلتر.

عندما يتم جمع جميع الأنسجة ، قم بالطرد المركزي للعينات ، وشفط المواد الطافية ، واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع قلب الأنبوب عدة مرات كل خمس دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.

في نهاية الحضانة ، أضف 30 ميكرولترا من الأنبوب المختلط بالإنزيم المحضر حديثا إلى كل عينة ، واقلب الأنابيب برفق. بعد ذلك، باستخدام ماصة باستور المسماة 1، افصل كل عينة ب 30 ماصة لأعلى ولأسفل، مع الحرص على تجنب توليد الفقاعات. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية مع انعكاس كل خمس دقائق، متبوعا بتفكيك العينات بماصة باستور رقم 2، كما هو موضح للتو.

ثم قم بالتبديل إلى الماصة رقم 3. كرر التفكك واحتضان العينات لمدة 10 دقائق أخرى في الحمام المائي ، مع الانعكاس كل خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بتصفية المعلقات أحادية الخلية من خلال مصافي خلية 80 ميكرون في أنابيب فالكون سعة 15 مليلتر ، واغسل كل مصفاة ب 10 مل من HBSS الخالية من الكالسيوم والمغنيسيوم لإيقاف التفاعلات الأنزيمية. عندما يتم ترشيح العينة الأخيرة ، قم بتدوير الأنابيب ، وشفط المواد الطافية.

لاستنفاد المايلين من معلقات الخلية ، قم بتعليق الكريات تماما في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ، وأضف الكمية المناسبة من حبات إزالة المايلين إلى كل أنبوب. قم بعرض المحاليل لأعلى ولأسفل حتى تختلط الخلايا والخرز جيدا. ثم احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل كل عينة في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين.

أثناء دوران الخلايا ، ضع عمودا واحدا لكل عينة في المجال المغناطيسي لفارز مغناطيسي ، وضع مرشحا نظيفا 80 ميكرون أعلى كل عمود. اشطف كل مرشح وعمود ب 1 ملليلتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ثلاث مرات ، واجمع كل التدفق في حاوية النفايات.

بعد الشطف النهائي ، ضع أنابيب دائرية القاع من البوليسترين سعة 5 ملليلتر أسفل كل عمود مباشرة لتجميع الشطف. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية من العينات ، وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين.

قم بتطبيق معلقات الخلية على الفور على الأعمدة ، وجمع الخلايا في الأنابيب أدناه. بعد ذلك ، اشطف كل مرشح وعمود 4 مرات باستخدام 1 مليلتر من محلول إزالة المايلين لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتدوير الخلايا واستنشاق المواد الطافية.