إنشاء مزارع الخلايا الدبقية المختلطة الأولية من الحبل الشوكي للفأر

حصاد الحبال الشوكية للفأر وتقطيعها إلى شظايا.

انقل الشظايا إلى أنبوب يحتوي على إنزيم محلل للبروتين و DNase. دوامة وحضانة.

يهضم الإنزيم المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، بينما يتحلل DNase للحمض النووي الحر الملوث

دوامة مرة أخرى والماصة بشكل متكرر لإكمال تفكك الأنسجة ، والحصول على تعليق أحادي الخلية.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في محلول يحتوي على DNase ومثبط للبروتياز والدوامة. يعمل المثبط على تحييد الإنزيم.

ضع طبقة من محلول المثبط الطازج في الأعلى ، وجهاز الطرد المركزي ، وقم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في وسط تدرج الكثافة ، والدوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي.

تستقر الخلايا في الأسفل ، بينما يظل حطام المايلين في الأعلى.

تخلص من الحطام. اغسل بشكل متكرر باستخدام المخزن المؤقت وجهاز الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط النمو.

لوحة الخلايا. يسهل السطح غير المطلي ارتباط الخلايا الدبقية.

قم بإزالة الوسائط المستهلكة وإضافة وسائط جديدة للحث على تكاثر الخلايا الدبقية ، وإنشاء ثقافة دبقية مختلطة.

من خلال العمل في غطاء مزرعة الأنسجة ، قم بنقل أربعة حبال شوكية للفأر إلى طبق بتري من HBSS. استخدم مقصا وملقطا معقما لتقطيع كل من الحبل الشوكي إلى قطع صغيرة. بعد ذلك ، انقل القطع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على خليط إنزيم غراء DNase. تجنب نقل HBSS إلى خليط الإنزيم لأن هذا قد يؤدي إلى انخفاض أداء الإنزيم.

من الأهمية بمكان أن يتم هضم قطع الأنسجة جيدا للحصول على معلق أحادي الخلية. ومع ذلك ، فإن الإفراط في الهضم سيؤدي إلى عدد أقل من الخلايا القابلة للحياة. يحتاج كل مختبر إلى إجراء اختبارات تجريبية لتحديد وقت الهضم الدقيق بناء على ما هو الأفضل لخلاياهم.

بعد ذلك ، قم بدوامة الأنبوب برفق ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز المداري بمعدل 150 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنبوب ، ثم قم بعمل ثلاثية الأنسجة بقوة باستخدام ماصة سعة 5 ملليلتر لتعزيز المزيد من التفكك. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أثناء الطرد المركزي ، أضف 300 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين المعاد تكوينه إلى 2.7 مل من EBSS في أنبوب معقم واخلطه جيدا. ثم أضف 150 ميكرولتر من محلول DNase. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في مثبط الألبومين الملقب حديثا ومحلول DNase. دوامة جيدا لكسر بيليه الخلية.

ثم أضف 3 ملليلتر من محلول مثبط الألبومين المعاد تكوينه بدون DNase إلى تعليق الخلية. الطرد المركزي للخلايا عند 70 مرة جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على شظايا الغشاء ، واحتفظ بالحبيبات.

لإزالة المايلين من خلايا الحبل الشوكي المنفصلة ، قم أولا بإضافة 8 مل من وسط التدرج بدرجة حرارة الغرفة بنسبة 20٪ في الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية والدوامة برفق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 مرة جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن تنكسر. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الطبقة العليا من الحطام بعناية ، والتي تحتوي في الغالب على المايلين ، والمادة الطافية التي تغادر الحبيبات.

لإزالة أي تدرج كثافة متبقي ، اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات ب 8 ملليلتر من cDMEM المخفف ب HBSS. الطرد المركزي للخلايا عند 400 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وغسل الخلايا باستخدام cDMEM المخفف كما كان من قبل.

بعد إزالة المادة الطافية ، يمكن تخزين الحبيبات على الجليد حتى زرع الخلايا. بمجرد أن تصبح جاهزا للطلاء ، أعد تعليق الخلايا في 14 مل من cDMEM المكملة ب 2-Mercaptoethanol ، وأضف 1 ملليلتر من تعليق الخلية إلى كل بئر في لوحة 12 بئر.

لوحة الآبار الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد متوسط عدد الخلايا لكل بئر ، ومحتوى الخلايا الدبقية الصغيرة للثقافة. بمجرد طلاء الخلايا ، احتضان الخلايا عند 35.9 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسيط في اليوم 1 ، وهو اليوم التالي للطلاء.

بعض الخلايا متصلة بلوحة الثقافة ، لكنها لا تزال مستديرة في الغالب. هناك أيضا العديد من الخلايا العائمة والحطام الكبير. كرر تغيير الوسائط بعد ثلاثة إلى أربعة أيام.