تمييز أسلاف الأذن متعددة القدرات الخالدة إلى الخلايا العصبية العقدية الحلزونية وتقييم التمايز

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على أغطية معقمة مطلية بركيزة زراعة الخلايا.

إدخال أسلاف الأذن متعددة القدرات الخالدة ، أو iMOPs ، في وسط التمايز العصبي.

iMOPs هي سلائف لخلايا الأذن الداخلية المختلفة ، بما في ذلك الخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، أو SGNs ، التي تنقل المعلومات السمعية إلى الدماغ.

احتضان ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالركيزة. يحفز الوسيط تمايز iMOPs إلى SGNs.

أضف مثبتا للحث على تشابك البروتين ، والحفاظ على مورفولوجيا الخلية ، ومحلول منظف لاختراق الأغشية الخلوية.

أدخل كاشف حجب لمنع وضع العلامات غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور الخاصة بعلامات التمايز العصبي واحتضانها ، مما يسمح للأجسام المضادة بتسمية SGNs.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، وقم بتركيب الأغطية بوسط تثبيت يحتوي على صبغة نووية فلورية.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، اكتشف إشارات الأجسام المضادة لتأكيد تمايز iMOPs إلى SGNs.

أولا ، قم بتنظيف الأغطية الزجاجية المستديرة عن طريق وضعها في صفيحة معقمة مقاس 100 ملم ، وغمرها في 70٪ من الإيثانول. حرك الغطاء برفق للتأكد من تغطيته واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اشطف الغطاء ثلاث مرات في 1x PBS معقم ثم مرة واحدة بالماء المعقم.

بعد ذلك ، اترك الأغطية تجف عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. للاستخدام الفوري ، ضع غطاء معقم واحد في كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، وقم بهز اللوحة برفق للتأكد من أن جميع الأغطية مسطحة. بعد ذلك ، قم بتغطية الغطاء بإضافة 0.25 مل من 1x PBS يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من poly-D-lysine إلى كل بئر.

بعد تحضين اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة محلول poly-D-lysine وغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS معقم. بمجرد شفط السائل من الغسيل الأخير ، أدخل 0.25 مل من 1x PBS يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من اللامينين في كل من الآبار ال 24. بعد احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، قم بشفط محلول اللامينين. بعد ذلك ، اغسل كل بئر ب 1 مليلتر من 1x PBS ثلاث مرات ، لكن اترك PBS من آخر غسلة في الآبار حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء.

لبدء التمايز العصبي ، عد الخلايا من الغلاف الأذني المنفصل كما هو موضح سابقا ثم أعد تعليقها في وسط تمايز الخلايا العصبية الدافئة مسبقا. استمر في البذر بين 1 و 1.5 × 10⁵ خلايا iMOP في كل بئر من اللوحة التي تحتوي على أغطية المغلفة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لتحل محل وسط التمايز العصبي كل يومين.

بعد سبعة أيام ، قم بشفط الوسط وإصلاح الخلايا ، التي يجب ربطها بطبقات الغطاء ، عن طريق إضافة 4٪ فورمالديهايد في كل بئر وتركها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة الفورمالديهايد وغسل الخلايا مرة واحدة في 1x PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100. بعد ذلك ، قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت وأضف المخزن المؤقت المانع الذي يتكون من 1x PBS يحتوي على 10٪ مصل ماعز عادي و 0.1٪ Triton X-100 لكل بئر.

اترك الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالة السائل واستبدله بمخزن مانع يحتوي على التخفيف المناسب للجسم المضاد Cdkn1b أو Tubb3. بعد حضانة ليلية عند 4 درجات مئوية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS يحتوي على 1٪ Triton X-100 ثم تابع التلوين المناعي كما هو موضح سابقا. بعد اكتمال التلوين ، قم بإجراء غسيل نهائي عن طريق إضافة 1x PBS إلى الآبار.

لإعدادها للتحليل ، قم بإزالة الغطاء الذي يتم إرفاق خلايا البقع به من اللوحة المكونة من 24 بئرا وضعها على وسط التثبيت على شريحة زجاجية. بعد ترك وسط التركيب يجف طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، احصل على صور epifluorescence كما هو موضح سابقا.