عزل وزراعة الخلايا العصبية الجنينية للكتكوت على مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية

خذ بيضة دجاج مخصبة تحتوي على جنين في مرحلة مبكرة.

عقم القشرة وافتحها بعناية.

إزالة الجنين. قم بتشريح الرأس ونقله إلى لوحة ثقافة تحتوي على مخزن مؤقت. قم بإزالة مقلة العين.

قم بعمل شق وإزالة طبقات الجلد ، وكشف الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط.

قم بإزالة الطبقة الغشائية الداخلية والأوعية الدموية. قم بتشريح ونقل الدماغ الأمامي إلى لوحة ثقافة ذات مخزن مؤقت.

قطع الأنسجة إلى أجزاء أصغر ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل. بمجرد أن تستقر الشظايا ، قم بإزالة المخزن المؤقت.

أضف محلول إنزيم محلل للبروتين. احتضان لهضم المصفوفة خارج الخلية للأنسجة وفك الخلايا العصبية.

قم بإزالة الوسائط الغنية بالإنزيم ، واغسلها بالوسائط القاعدية العصبية ، وإزالة أي إنزيمات متبقية.

أضف الوسائط العصبية القاعدية. فصل الأنسجة ميكانيكيا للحصول على تعليق عصبي.

قم بزرع هذه الخلايا العصبية على نظام مصفوفة متعدد الأقطاب الكهربائية مغطى بمصفوفة خارج الخلية. أضف الوسائط العصبية القاعدية واحتضنها.

الخلايا العصبية بربط الإسقاطات وتوسيعها ، وتشكل شبكة عصبية.

في يوم طلاء الخلايا العصبية ، قم بإزالة قارورة من المصفوفة خارج الخلية من الفريزر -20 درجة مئوية. يرش ب 70٪ من الإيثانول ويوضع على الثلج. تأكد من إذابة المصفوفة خارج الخلية على الجليد. لا تذوب في درجة حرارة الغرفة ، حيث يتبلمر ECM فوق 0 درجة مئوية.

اعمل في غطاء محرك BSL-2 لتخفيف المصفوفة خارج الخلية إلى 25٪ عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي البارد إلى حصة 100 ميكرولتر. بعد ذلك، استخدم ماصة P200 لإضافة 100 ميكرولتر من محلول مصفوفة خارج الخلية بنسبة 25٪ إلى مركز مصفوفة الأقطاب الكهربائية المتعددة، مع الحرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية. قم بإزالة ECM على الفور ، مع ترك طبقة رقيقة على السطح.

قم بتغطية مجموعة الأقطاب الكهربائية المتعددة ، وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصبح جاهزة لصفيحة الخلايا العصبية. ابدأ عزل الخلايا العصبية للكتكوت عن طريق تعقيم القشرة الخارجية لبيضة E7 بنسبة 70٪ من الإيثانول. من المهم الحفاظ على ظروف معقمة من هذه النقطة فصاعدا. تأكد من تعقيم جميع الأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول وأن المحاليل معقمة. من المفيد استخدام غطاء التشريح ولكنه ليس ضروريا تماما للتشريح ، إذا تم إجراؤه بسرعة.

ثم ، بعد استرجاع الجنين وقطع رأسه ، قم بقص العينين وإزالة مقل العيون. بعد ذلك ، استخدم ملقط دومون رقم 5 الناعم ومقص الزنبرك لعمل شق على الجانب البطني وإزالة الطبقات الخارجية من الجلد لفضح الدماغ الأمامي والأذن. قشر وإزالة غشاء التقشير بعناية.

انقل الدماغ الأمامي إلى طبق بتري آخر يحتوي على HBS وقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة من حوالي 2 ملم بمقص زنبركي. استخدم ماصة نقل معقمة لنقل قطع الدماغ الأمامي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. بعد أن تغرق قطع الدماغ الأمامي في قاع أنبوب الطرد المركزي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من HBS.

بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من 0.5٪ تريبسين EDTA الدافئ مسبقا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم ماصة باستور لإزالة التربسين بعناية دون إزعاج قطع الأنسجة. أضف 1 مليلتر من الوسط العصبي القاعدي واترك قطع الأنسجة تغرق في الأسفل. بعد إزالة الوسط وتكرار الغسيل ، أضف 2 مل من الوسط العصبي القاعدي وقم بترتيتوريه برفق حتى لا ترى المزيد من قطع الأنسجة.

قم بتخفيف الخلايا المعلقة من 1 إلى 10 بوسط عصبي قاعدي ، وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة التربان الزرقاء ومقياس كثافة الدم. بعد العد ، قم بلوحة الخلايا المرتبطة على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية المطلية ب ECM بكثافة 2,200 خلية لكل ملليمتر مربع.