توليد رقاقة حاجز الدم الدماغي باستخدام الخلايا السليفة المشتقة من iPSC

خذ شريحة مائع دقيقة مع قنوات متراكبة ومغلفة بمصفوفة مفصولة بغشاء مسامي.

خلايا السلف العصبية المشتقة من iPSC في القناة العلوية. احتضن الالتصاق الخلية ، ثم اغسله لإزالة الخلايا غير المتصلة.

التالى, البذور الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ المشتقة من iPSC في القناة السفلية.

اقلب الرقاقة واحتضانها لربط الخلايا البطانية بجانب الغشاء من القناة السفلية.

بعد ذلك ، اقلب الشريحة لربط الخلايا بالجانب السفلي من القناة ، لتشكيل هيكل أحادي الطبقة يشبه الأنبوب. اغسل كلتا القناتين بوسائط خاصة بالخلية.

قم بتدفق وسيط التمايز العصبي باستمرار في القناة العلوية ووسط الخلية البطانية في القناة السفلية.

تستخدم الخلايا البطانية عوامل النمو من الوسط إلى الناضج وتشكل تقاطعات ضيقة تشبه الأوعية الدموية ، وتشكل جانب الدم.

تؤدي العوامل العصبية إلى تمايز الخلايا السلفية العصبية إلى خلايا دماغية مختلفة ، وتشكيل جانب الدماغ. تتفاعل هذه الخلايا مع الخلايا البطانية ، مما يخلق حاجزا دماغويا على الشريحة.

للبدء ، أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المحضرة إلى خزانة السلامة الحيوية. باستخدام ماصة P200، اغسل كلتا القناتين برفق عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من وسط التمايز العصبي إلى المدخل وسحب السائل من المخرج. تجنب ملامسة المنافذ ، قم بشفط قطرات الوسائط الزائدة بعناية من سطح الشريحة.

حرك تعليق الخلية برفق لضمان تعليق خلية متجانس. لزرع الخلايا السلفية العصبية المشتقة من iPSC في القناة العلوية لتوليد جانب الدماغ, إضافة طرف P200 يحتوي على 30 إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية بتركيز 1 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر إلى مدخل القناة العلوي, وتحرير الحافة برفق من الماصة.

خذ ماصة P200 فارغة للضغط على المكبس، وأدخلها في مخرج القناة العلوية، واسحب التعليق أحادي الخلية بعناية عبر الطرف. انقل الشريحة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر في التوزيع المتجانس للخلايا داخل القناة العلوية. بعد التأكد من كثافة الخلية عند تغطية 20٪ ، ضع الرقائق على الفور في الحاضنة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا التي لا تلتصق بإضافة وسيط تمايز عصبي جديد إلى المدخل ، وتجميع السائل بواسطة ماصة من المخرج. حافظ على الخلايا في ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية مع استبدال وسط التمايز العصبي اليومي. بعد أن تعلق iNPCs أو في يوم لاحق بعد البذر, أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المحضرة إلى خزانة السلامة الحيوية. اغسل القناة السفلية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من وسط الخلية البطانية.

تجنب ملامسة المنافذ ، قم بشفط قطرات من وسط الخلية البطانية الزائدة بعناية من سطح الرقاقة ، مع التأكد من ترك الوسط في كلتا القناتين. حرك تعليق الخلية برفق لضمان تعليق خلية متجانس. باستخدام ماصة P200، اسحب ما يصل إلى 30 إلى 100 ميكرولتر من معلق الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ المشتق من iPSC بتركيز 14 إلى 20 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر، ووضع الطرف في مدخل القناة السفلية.

الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق خصائص الحاجز الوظيفي هي بذر الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. من الأهمية بمكان زرع الخلايا بكثافة مناسبة لتجنب تكوين الفقاعات للتحقق من التوزيع المتجانس داخل غمد العضو.

اضغط على المكبس الموجود على ماصة P200 بطرف فارغ، وأدخله في مخرج القناة السفلية، ثم حرر مكبس الماصة ببطء لسحب التعليق أحادي الخلية بعناية عبر القناة السفلية. استنشق تعليق الخلية الزائد من سطح الشريحة. تجنب الاتصال المباشر بمنافذ المدخل والمخرج لضمان عدم سحب تعليق الخلية من القنوات. انقل الشريحة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر.

تمتلئ القناة السفلية بالخلايا التي لا توجد بها فجوات يمكن ملاحظتها بينهما. بعد التأكد من كثافة الخلايا الصحيحة ، قم بزرع الخلايا في الرقائق المتبقية. لربط الخلايا بالغشاء المسامي ، الموجود أعلى القناة السفلية ، اقلب كل شريحة واتركها ترتاح في مهد رقاقة. ضع خزانا صغيرا يحتوي على DPBS معقمة داخل الطبق 150 ملم لتوفير الرطوبة للخلايا.

احتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا أو حتى تلتصق الخلايا الموجودة في القناة السفلية. بمجرد أن ترتبط الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة المشتقة من iPSC ، اقلب الرقائق مرة أخرى إلى وضع رأسي للسماح بربط الخلية بالجزء السفلي من القناة السفلية. 48 بعد ساعات من البذر من الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ مشتقة من iPSC, موازنة درجة حرارة وسط الخلية البطانية عن طريق الاحترار في 37 حمام مائي درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الغاز من الوسط عن طريق الحضانة تحت نظام ترشيح يعمل بالفراغ لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتعقيم الجزء الخارجي من عبوة الوحدة المحمولة والصواني بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسحها ، وانقلها إلى خزانة السلامة الحيوية. افتح العبوة، وضع الوحدات في الدرج. قم بتوجيههم بالخزانات باتجاه الجزء الخلفي من الدرج. ماصة 3 ملليلتر من الوسائط الدافئة المتوازنة مسبقا لكل خزان مدخل. أضف وسط زراعة الخلايا البطانية إلى خزان مدخل القناة السفلية ووسط التمايز العصبي إلى خزان مدخل القناة العلوي للقناة العلوية.

بعد ذلك، قم بنقل 300 ميكرولتر من الوسائط الدافئة المتوازنة مسبقا إلى كل خزان مخرج مباشرة فوق كل منفذ مخرج. ضع ما يصل إلى 6 وحدات محمولة على كل درج. أحضر الصواني إلى الحاضنة ، وانزلق بالكامل في وحدة الثقافة بحيث يكون مقبض الدرج متجها للخارج. حدد الدورة الأولية وقم بتشغيلها على الوحدة النمطية للثقافة. أغلق باب الحاضنة ، واسمح لوحدة الثقافة بتجهيز الوحدات المحمولة لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

تكتمل دورة التحضير عندما يقرأ شريط الحالة "جاهز". قم بإزالة الدرج من وحدة الاستزراع وإحضاره إلى خزانة السلامة البيولوجية. افحص الجانب السفلي من كل وحدة محمولة في خزانة السلامة الحيوية للتحقق من أن الوحدات المحمولة قد تم تجهيزها بنجاح. ابحث عن وجود قطرات صغيرة في جميع المنافذ الأربعة. إذا كانت أي وحدة نمطية محمولة لا تظهر قطرات، فأعد تشغيل الدورة الأولية على هذه الوحدات النمطية. إذا تقطت أي وسائط على الدرج ، وهو ما يحدث في كثير من الأحيان بواسطة منافذ المنفذ ، فقم بتنظيف الدرج بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بعد ذلك ، اغسل كلتا القناتين من كل شريحة برفق باستخدام وسيط ثقافة دافئ متوازن خاص بالخلية لإزالة أي فقاعات محتملة في القناة ، وضع قطرات صغيرة من الوسائط في الجزء العلوي من كل منفذ مدخل ومخرج. أدخل الرقائق مع الناقلات في الوحدات المحمولة ، وضع ما يصل إلى ستة على كل درج. أدخل الأدراج في وحدة الثقافة. قم ببرمجة ظروف زراعة رقاقة الأعضاء المناسبة ، مثل معدل التدفق والتمدد على وحدة الاستزراع. بمجرد اكتمال دورة التنظيم ، والتي تستغرق حوالي ساعتين ، تبدأ الشروط المبرمجة. بعد ذلك ، تبدأ وحدة الثقافة في التدفق في ظروف زراعة رقاقة الأعضاء المحددة مسبقا.