$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
خذ جنين فأر في مخزن مؤقت وافصل الجمجمة لعزل الدماغ.
قم بإزالة السحايا ، الطبقة الغشائية التي تغطي الدماغ.
تشريح الدماغ لفصل نصفي الكرة الأرضية.
عزل الدماغ الظهري الوحشي من نصفي الكرة الأرضية ونقلها إلى أنبوب.
الدماغ الظهري الوحشي غنية بالخلايا العصبية والخلايا السلفية العصبية.
جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.
أضف محلول إنزيم. تقوم الإنزيمات بتكسير مصفوفة الأنسجة ، مما يؤدي إلى فك الخلايا.
أدخل وسط تكاثر يحتوي على مصل. تمنع بروتينات المصل نشاط الإنزيم.
استخدم ماصة لفصل الأنسجة ميكانيكيا ، وتشكيل معلق خلوي.
جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية التي تحتوي على إنزيمات معطلة وبقايا الأنسجة.
أعد تعليق الخلايا في وسط التكاثر.
انقل الخلايا إلى صفيحة دقيقة مطلية بالركيزة لزراعة الخلايا.
احتضان الخلايا للالتصاق بالركيزة. يسهل الوسيط تكاثر الخلايا السلفية.
ابدأ بإزالة الأدمغة من 5 إلى 10 أجنة E14 في طبق بتري مع وسط تشريح بارد. استخدم الملقط لسحب الجلد والجمجمة بعناية وعزل الدماغ. أثناء العمل تحت المجهر المجسم ، استخدم ملقط التشريح لإزالة السحايا. ثم قم بتقسيم telencephalon في المنتصف لفصل نصفي الكرة الأرضية.
لعزل telencephalon الظهري الجانبي قطع على طول منحنى الظهري والحدود السطحية تحت الجذعية. انقل الدماغ الظهري الوحشي إلى أنبوب سعة 2 مليلتر مع وسط تشريح على الجليد حتى يتم تشريح جميع الأدمغة. بعد التشريح المجهري للدماغ الظهري الجانبي ، ضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة المجمعة ووسط التشريح البارد لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية و 340 مرة جم لترسيب الأنسجة. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام الماصة ، وأضف 1 مليلتر من 37 درجة مئوية 0.05٪ تريبسين-EDTA للهضم الكيميائي. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، أضف 2 مل من وسط التكاثر لتثبيط نشاط التربسين. بعد ذلك ، قم بتلميع طرف ماصة باستور الزجاجية فوق موقد غاز أو موقد بنسن لبضع ثوان لتضييق الفتحة قليلا. قم بالشفط FCS لتغطية طرف الماصة. بعد ذلك، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن ماصة باستور المصقولة بالنار والمغلفة ب FCS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مع توخي الحذر لتجنب توليد الفقاعات.
الطرد المركزي للخلايا المنفصلة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية و 340 مرة جم ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. ثم أضف 1 مليلتر من وسط التكاثر وأعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة. قم بإزالة PBS من اللوحة المعالجة مسبقا باستخدام poly-D-lysine. بعد ذلك ، ارسم علامة في الجزء السفلي من اللوحة يمكن استخدامها كمرجع لتحديد نقطة الصفر.
بعد إعادة تعليق الخلايا في وسط التكاثر للمرة الثانية ، قم بإعداد تخفيف 1 إلى 1 لتعليق الخلية باستخدام محلول تريبان أزرق بنسبة 0.4٪. قم بالتحميل في شرائح غرفة العد واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة غير الملوثة. ستكون الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء. خفف الخلايا في وسط التكاثر للحصول على 106 خلايا لكل مليلتر. أضف 500 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.