إنشاء ثقافة خلايا العقد الجذرية الجذرية الأولية من العمود الفقري للفئران

خذ العمود الفقري للفئران. قم بعمل قطعتين على جانبيها وقطع جانبي واحد.

إزالة العضلات الظهرية والجزء الظهري من الفقرات.

استخرج الحبل الشوكي.

تحديد العقد الجذرية الظهرية ، أو DRGs ، الموجودة بشكل ثنائي على طول الفقرات القطنية.

تحتوي DRGs على خلايا عصبية محاطة بالخلايا الدبقية.

استئصال DRGs وجمعها في طبق. اغسل المنديل بشكل متكرر بوسائط خالية من المصل.

انقل DRGs إلى صفيحة تحتوي على محلول كولاجيناز واحتضنها. الكولاجيناز يحط من المصفوفة خارج الخلية.

يغسل مع العازلة. أضف التربسين-EDTA واحتضن لتعطيل تقاطعات الخلايا والخلايا ، مما يؤدي إلى تخفيف الخلايا.

انقل DRGs إلى أنبوب ، وجهاز طرد مركزي ، وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الأنسجة في وسط المزرعة والماصة بشكل متكرر لتحرير الخلايا.

انقل الخلايا إلى لوحة ثقافة مطلية بالبوليمر جيدا لتسهيل الارتباط.

قم بإزالة الوسائط وإضافة وسائط جديدة تحتوي على مثبطات وعوامل نمو.

تحد المثبطات من تكاثر الخلايا الدبقية ، بينما تعزز عوامل النمو نمو الخلايا العصبية.

اجمع العقد الجذرية الظهرية القطنية من جذع فأر عمره أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. ابدأ بعمل قطعتين على جانبي العمود الفقري وقطع جانبي واحد لتحديد المدى المنقاري للعمود الفقري القطني. ثم استخدم ملقط قطع العظام لإزالة العضلات الظهرية للعمود الفقري. بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء الظهري من الفقرات وكشف الحبل الشوكي ، ثم استخدم مقص التشريح والملقط لإزالة الحبل الشوكي.

حدد DRG القطني عن طريق حساب الفقرات من الضلع الأخير. يوضح هذا الشكل مواضع الفقرات. استخدم المقص الدقيق لجمع 12 DRG القطني الثنائي من L1 إلى L6. قم بإزالة أي ألياف عصبية متصلة لتحسين نقاء الثقافة. انقل كل DRG قطني إلى طبق استزراع مقاس 35 ملم يحتوي على 2 مل من وسط مصل خال من الثلج.

انقل الطبق الذي يحتوي على DRG مقاس 35 ملم إلى غطاء رقائقي ، واغسل DRG بوسط خال من المصل ثلاث مرات بواسطة الماصة. استخدم ملاقط معقمة لنقل DRGs إلى طبق استزراع جديد مقاس 35 ملم يحتوي على 2 مل من الكولاجيناز المعقم من النوع 1A. ضع الأنسجة في محلول الكولاجيناز في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لبدء تفكك الخلايا.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الكولاجيناز ، واغسل DRG ثلاث مرات في 2 مل من محلول الملح المتوازن من هانك. بعد ذلك ، أضف 2 مل من 0.05٪ trypsin-EDTA المسخن مسبقا إلى الطبق ، وهضم DRG في الحاضنة لمدة 30 دقيقة كما كان من قبل. بعد الهضم ، استخدم ماصة زجاجية لنقل 2 مل من المحلول المحتوي على DRG إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا.

قد تلتصق DRG بالماصة الزجاجية ، لذا يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية. يمكن تجنب فقدان DRG عن طريق الاحتفاظ بالمحلول المحتوي على DRG في الطرف المدبب للماصة الزجاجية ونقل المحلول إلى أنبوب الطرد المركزي ببطء ولكن دون توقف.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 290 مرة جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 2 مل أخرى من الوسط الخالي من المصل لإعادة تعليق DRG. كرر الغسيل مرتين باستخدام 2 مل من وسط الثقافة الدافئ مسبقا لإعادة تعليق الأنسجة بعد الطرد المركزي النهائي.

استخدم الماصة المعقمة المصقولة باللهب المعدة مسبقا لتقليص DRG يدويا 60 مرة تقريبا. بعد ذلك ، قم بإزالة صفيحة 24 بئرا مطلية ب poly-L-lysine تحتوي على 1 مليلتر من وسط الثقافة لكل بئر من حاضنة CO2. استنشق وسط الثقافة المحتضنة من الطبق.

قم بزرع خلايا DRG من فأر واحد إلى أربعة من الآبار. هذا يعطي كثافة بذر تبلغ حوالي 500,000 خلية لكل بئر. في اليوم التالي ، استبدل وسط الاستزراع بوسط مكمل ب 10 ميكرومولار AraC ، و 100 نانوجرام لكل مليلتر NGF.