توليد نموذج ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد للأرومات الليفية والقرنية البشرية والخلايا العصبية

خذ الخلايا الليفية للقرنية البشرية.

انقلها إلى غشاء داخل صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط.

أضف وسائط إلى ملحق الغشاء. احتضان الالتصاق بالخلايا الليفية للإدخال.

بعد ذلك ، استبدل الوسائط بوسائط تحتوي على فيتامين سي في إدراج الغشاء والخزان.

حضن. يحفز فيتامين ج الخلايا الليفية على إفراز وتجميع مصفوفة ثلاثية الأبعاد خارج الخلية.

أضف تعليق خلية الورم الأرومي العصبي البشري فوق الخلايا الليفية.

احتضان ، مما يسمح بالتصاق خلايا الورم الأرومي العصبي.

الآن ، أضف الوسائط التي تحتوي على حمض الريتينويك فوق الخلايا واستكمل الخزان بوسائط جديدة.

حضن. يؤدي حمض الريتينويك إلى تمايز خلايا الورم الأرومي العصبي إلى خلايا سلف عصبية.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط. أدخل وسائط جديدة إلى الخزان. أضف وسائط تحتوي على عامل تغذية عصبية إلى الغشاء واحتضنها.

تؤدي العوامل العصبية إلى تمايز الخلايا السلفية إلى خلايا عصبية ، مما يؤدي إلى إنشاء نموذج ثقافة مشتركة ثلاثي الأبعاد للأرومات الليفية والعصبية في القرنية البشرية.

لتجميع التركيبات ثلاثية الأبعاد ، أولا ، المرور وحساب الخلايا الليفية للقرنية البشرية. بعد ذلك ، قم بالبذور تقريبا 1 مرات 10 إلى 6 HCFs على غشاء بولي كربونات مع مسام 0.4 ميكرون. أضف 1.5 مل من الوسط الطازج إلى الجزء العلوي من البناء. بعد ذلك ، قم بإخراج 1.5 مل أخرى من نفس الوسائط إلى أسفل كل بناء.

بعد 24 ساعة ، أضف 1.5 مل من الوسط المكمل ب 0.5 ملليمولار فيتامين سي إلى أعلى وأسفل كل بناء. احتضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أسابيع ، مع إضافة وسائط جديدة تحتوي على فيتامين سي كل يومين. سيحفز هذا الخلايا على إفراز وتجميع مصفوفة خارج الخلية الخاصة بها. بعد ثلاثة أسابيع ، أضف 8 أضعاف 10 إلى 3 خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y في الجزء العلوي من التركيبات ثلاثية الأبعاد التي تم تجميعها مسبقا.

من الأهمية بمكان حساب عدد الخلية الدقيق في هذه الخطوة والسماح ب 24 ساعة قبل بدء تمايز الخلايا.

بعد 24 ساعة من الحضانة ، ابدأ تمايز خلايا SH-SY5Y عن طريق تحفيز الخلايا ب 1.5 مل من EMEM مع 10٪ FBS و 10 حمض الريتينويك الميكرومولاري. ثم أضف 1.5 مل من الوسط الذي يحتوي على فيتامين سي إلى قاع البنية. حمض الريتينويك حساس للضوء ، لذا يجب تنفيذ هذه الخطوة في الظلام.

بعد خمسة أيام ، عندما وصلت الخلايا إلى مرحلة التمايز ، أضف 1.5 مل من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على 2 نانومولار BDNF و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات إلى الجزء العلوي من البناء. أضف وسيطا طازجا مكملا بفيتامين سي إلى قاع البناء. استزراع الخلايا لمدة يومين إضافيين قبل المعالجة لمزيد من التحليل.