عزل البروتينات السطحية وداخل الخلايا عن ثقافة الخلايا النجمية

خذ ثقافة الخلايا النجمية وقم بإزالة الوسط. أضف عازلة فسيولوجية واحتضن على الجليد ، مما يثبط الالتقام الخلوي لبروتينات سطح الخلية.

احتضان بكاشف البيوتينيل الذي يربط بروتينات سطح الخلية.

بعد ذلك ، احتضن مع مخزن مؤقت للتبريد لإلغاء تنشيط أي كاشف غير متفاعل.

أضف عازلة فسيولوجية باردة وافصل الخلايا ميكانيكيا. انقل الخلايا ، ثم جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية.

احتضان مع مخزن مؤقت للتحلل للخلايا ، وإطلاق بروتينات داخل الخلايا على سطح الخلية الحيوية وغير الحيوية.

جهاز الطرد المركزي ، وجمع المادة الطافية ، وفصل جزء من محتوى البروتين الكلي.

احتضان الجزء المتبقي تحت التحريض بالخرز المطلي بالستربتافيدين الذي يربط البروتينات الحيوية.

قم بتدوير الخرزات المرتبطة بالبروتين على سطح الخلية وافصل المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات داخل الخلايا.

اغسل الخرزات تحت التحريض لإزالة البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد ، ثم قم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية ، وعزل بروتينات سطح الخلية.

الكسور التي تحتوي على البروتينات الكلية وداخل الخلية وسطح الخلية جاهزة للتحليل.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة وتخلص من الوسط عن طريق الشفط. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 ملليلتر من CM-PBS المبرد ، وضع الأطباق على الثلج المجروش.

قم بإزالة CM-PBS عن طريق الشفط ، ثم قم بإدخال ملليلترين من محلول البيوتين في كل بئر. قم بإمالة الأطباق برفق ذهابا وإيابا عدة مرات ، لضمان التغطية الكاملة قبل وضع المزارع على الجليد لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للبيوتين ، واستبدله بأربعة ملليلتر من محلول التبريد ، واحتفظ بالثقافات على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالشفيق واستبداله بنفس الكمية من مخزن التبريد قبل ترك المزارع على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، تخلص من مخزن التبريد واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 ملليلتر من CM-PBS المبرد. بعد ذلك ، اكشط الخلايا إلى مليلتر واحد من CM-PBS المبرد وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد ذلك ، قم بتكبيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 جم لمدة ثلاث دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل.

ثم اترك العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة ، مع الدوامة كل خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 14,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات أي منظف ومواد قابلة للذوبان. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. وفر 50 ميكرولترا من المحللة وأضف 25 ميكرولترا من مخزن التحميل 3x إليه.

بعد ذلك ، قم بتغيير طبيعته عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية في حمام جاف. هذا هو جزء الإدخال الذي يحتوي على كل من بروتينات سطح الخلية الحيوية ، بالإضافة إلى البروتينات العصارية الخلوية غير البيوتينية. باستخدام طرف ماصة مقطوع ، انقل 75 ميكرولترا من حبيبات الستربتافيدين agarose إلى المحللة ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على شاكر.

بعد ذلك ، قم بتكسير حبات الستربتافيدين الاغاروز عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. وفر 50 ميكرولترا من المادة الطافية ، وأضف 25 ميكرولترا من مخزن التحميل 3x. ثم قم بتغيير طبيعته عند 95 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تدفئة. يمثل هذا الجزء داخل الخلايا ويتكون بشكل أساسي من بروتينات العصارة الخلوية غير البيوتينية.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخرز المحبب في مليلتر واحد من محلول الغسيل ، وهزه لمدة ثلاث دقائق عند 4 درجات مئوية. حبيبات الخرز وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية أربع مرات أخرى لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير البيوتينية.

أضف 50 ميكرولترا من مخزن التحميل المخفف إلى 1x باستخدام المخزن المؤقت للتحلل. إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرزات عن طريق تغيير طبيعتها عند 95 درجة مئوية. يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الحيوية فقط.