عزل ألياف الأميلويد من مستخلص أنسجة المخ

خذ مستخلص أنسجة دماغ الفأر الذي يحتوي على بروتينات غير أميلويد وألياف أميلويد ، وهي مجموعة بروتينية غير قابلة للذوبان.

يضاف السكروز الصلب ويخلط ، مما يزيد من كثافة المحلول.

انقله وجهاز الطرد المركزي لفصل البروتينات الأكثر كثافة عن الحطام.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت بتركيز أعلى من السكروز ، واخلطها وأجهزة الطرد المركزي.

اجمع الطبقة العليا التي تحتوي على عدد قليل من ألياف الأميلويد في أنبوب جديد ، وأضف مخزن الغسيل ، واخلطها.

الآن ، تخلص من الطبقة الوسطى وانقل الحبيبات المخصبة بألياف الأميلويد إلى الأنبوب الذي يحتوي على جزء الطبقة العليا لتحقيق أقصى قدر من العزل.

الطرد المركزي الكسور المجمعة والتخلص من المادة الطافية. أضف حاجزا مؤقتا للهضم واحتضنه لتحلل البروتينات غير النشوانية حصريا.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. اغسل الحبيبات لإزالة البروتينات المهضومة المتبقية.

أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت للذوبان قائم على السكروز يحتوي على منظف يذوب البروتينات غير النشوانية المتبقية.

أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق ألياف الأميلويد المعزولة.

ابدأ بوضع منطقة من أنسجة المخ تم تشريحها حديثا أو مجمدة في أنبوب سعة ملليلتر يحتوي على ستة إلى ثمانية حبات خزفية ومخزن تجانس مثلج طازج. بعد ذلك ، قم بطحن الأنسجة باستخدام الخالط مطحنة الخرزة عند 4,000 دورة في الدقيقة ، مع دورتين مدة كل منهما 30 ثانية على النبض وإيقاف تشغيله. الآن ، أضف تسعة ملليلتر من مخزن التجانس البارد المثلج إلى المليلتر الواحد من أنسجة المخ المتجانسة في أنبوب سعة 15 مليلتر ، وأغلقها بشرائط غشاء شمع مختبرية.

لضمان الذوبان القوي ، حافظ على دوران الأنبوب طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، أضف السكروز الصلب إلى تعليق مستخلص الأنسجة إلى تركيز نهائي يبلغ 1.2 مول. اخلطي جيدا وأجهزة الطرد المركزي على حرارة 250.000 مرة جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول التجانس الذي يحتوي على 1.9 سكروز مولي عن طريق التخلي والطرد المركزي عند 125,000 مرة جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي، انقل الطبقة الصلبة البيضاء العلوية إلى أنبوب جديد، وقم بإذابتها في 1 ملليلتر من محلول الغسيل المثلج البارد عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. نظرا لأن الحبيبات غنية أيضا بألياف الأميلويد ، فتخلص من الطبقة الوسطى المائية ، واجمع الحبيبات مع الطبقة العليا للحصول على عائد أعلى. جهاز الطرد المركزي للكسور المجمعة عند 8,000 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول الهضم المثلج ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على دوامة. الطرد المركزي للعينة مرة أخرى ، ثم اغسل الحبيبات مرتين في 1 مليلتر من محلول تريس المثلج ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد الغسيل الثاني ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول الذوبان عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب بسرعة عند 200,000 مرة جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

احتفظ بالحبيبات ، ثم قلل تركيز السكروز من 1.3 إلى 1 مولار عن طريق إضافة 50 مليمولار من المخزن المؤقت Tris إلى المادة الطافية. جهاز الطرد المركزي المادة الطافية مرة أخرى ، ثم قم بإذابة كلتا الكريات في 100 ميكرولتر من محلول Tris الذي يحتوي على 0.5٪ SDS. لتنقية الأميلويد ، قم بإذابة الكريات الغنية بالأميلويد باستخدام الموجات فوق الصوتية في جهاز صوتنة الحمام لمدة 20 دورة. بعد ذلك ، قم على الفور بالطرد المركزي للمادة عند 20,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من 0.5٪ SDS Tris buffer ، وكرر الغسيل أربع مرات أخرى. بعد خطوة الطرد المركزي النهائية ، اغسل الحبيبات في 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، وجهاز الطرد المركزي عند 20,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة أي منظف متبقي. قم بإذابة الحبيبات النهائية التي تحتوي على ألياف الأميلويد المنقاة في 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء.