تقييم صلاحية الخلايا العصبية في ثقافة الخلايا العصبية المخيخية عن طريق التلوين المزدوج

ابدأ بلوحة مزرعة معالجة بعامل مضاد للانقسام يمنع نمو الخلايا الدبقية ، تاركا في المقام الأول الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وعددا صغيرا من الخلايا الدبقية.

قم بإزالة الوسط وأضف ببطء المحلول الملحي المخزن بالفوسفات البارد أو PBS للحفاظ على صلاحية الخلية.

استبدل المخزن المؤقت بخليط تلطيخ بارد واحتضانه.

يحتوي هذا الخليط على ثنائي أسيتات الفلورسين أو FDA ، وهو مركب غير فلوري ، ويوديد البروبيديوم أو PI ، وهي صبغة فلورية غير منفذة للغشاء.

تنتشر إدارة الغذاء والدواء في الخلايا ، حيث يقوم الإستراز الوظيفي في الخلايا الحية بتحويله إلى مركب فلوري أخضر.

يدخل PI في الخلايا الميتة من خلال الأغشية التالفة ، ويرتبط بالحمض النووي ، وينبعث منه مضان أحمر.

قم بإزالة محلول التلوين وأضف PBS البارد لمنع الخلايا من الجفاف.

احصل على صور الفلورسنت لبقع FDA و PI وصورة تباين الطور. دمج صور إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وPI.

ثم قارن هذه الصورة المضان مع صورة تباين الطور ، مما يساعد على استبعاد الخلايا الدبقية الكبيرة.

يشير التألق الأحمر إلى موت الخلايا العصبية ، بينما يشير التألق الأخضر إلى قابلية الخلايا العصبية.

ابدأ التلوين بخلط ثنائي أسيتات الفلوريسئين إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر ويوديد البروبيديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل مليلتر في 10 ملليلتر من PBS. امزج محلول FDA PI عن طريق الدوامة وضعه على الثلج. ضع طبق الثقافة على الجليد.

استنشق وسط المزرعة بعناية دون لمس الخلايا بطرف الماصة. ثم أضف PBS البارد ببطء. قم بشفط PBS ، ثم أضف حل العمل FDA PI أو FDA PI Hoechst. ضع الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، بعد شفط حل عمل FDA PI أو FDA PI Hoechst ، أضف PBS باردا إلى كل بئر.

تأكد من إعداد المجهر الفلوري بشكل صحيح. اكتشف انبعاثات التألق ل FDA PI و Hoechst عند 520 و 620 و 460 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام وقت التعرض بين 100 و 300 مللي ثانية وكسب تناظري قدره 2.8X. بعد جمع صور التألق ، التقط صورة تحت الضوء العادي باستخدام وضع تباين الطور.

بالنسبة للتلوين المزدوج FDA PI ، قم بتراكب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء أعلى الطبقة الموجبة PI في برنامج تحرير الرسومات. اضبط عتامة الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء عن طريق إدخال 50٪ في حقل التعتيم في لوحة Layers. ادمج طبقتين عن طريق فتح قائمة الطبقة والنقر فوق الزر Merge Visible. قم بتعيين تباين الصور المتراكبة عن طريق إدخال 50 في حقل التباين ضمن الصورة ، التعديلات ، السطوع / التباين. تأكد من عدم وجود خلايا موجبة مزدوجة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وPI في صور التراكب.

بالنسبة للتلوين الثلاثي FDA PI Hoechst ، قم بتراكب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الإيجابية لإدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على الطبقة الإيجابية PI ، وضبط عتامة الطبقة الإيجابية لإدارة الغذاء والدواء ، ودمج الصور كما كان من قبل. ثم اسحب الطبقة الموجبة Hoechst على الطبقة المدمجة.

اضبط عتامة طبقة Hoechst-muabation عن طريق إدخال 50٪ في حقل التعتيم في لوحة Layers ، ودمج الطبقتين عن طريق فتح قائمة Layer والنقر فوق الزر Merge Visible. يميز بصريا الخلايا الدبقية الكبيرة غير المنتظمة عن الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية من خلال مقارنة الصور الملتقطة في وضع الفلورسنت مع تلك التي تم التقاطها في وضع تباين الطور.