تصور الخلايا العصبية لجسم الفطر في أدمغة ذبابة الفاكهة عن طريق التلوين المناعي

ضع أدمغة ذبابة الفاكهة البرية والمتحورة في محلول يحتوي على مثبت ومنظف. احتضن مع هزاز لطيف.

يحافظ المثبت على مورفولوجيا الأنسجة ، بينما يتخلل المنظف أغشية الخلايا.

اسمح للأدمغة بالاستقرار ، ثم قم بإزالة المحلول.

اغسل الأنسجة بمخزن مؤقت.

أضف محلول حجب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد.

قم بإزالة المحلول وأضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينا معينا ينظم التطور المحوري في جسم الفطر في الدماغ، أو الخلايا العصبية MB.

احتضان لتعزيز ارتباط الأجسام المضادة.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

اغسل مرة أخرى لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، ثم أعد تعليق الدماغ في وسط تصاعد.

قم بتركيب الأدمغة على شريحة جسر وتصورها تحت المجهر الفلوري.

بالمقارنة مع النوع البري ، تظهر الأدمغة الطافرة نمطا ظاهريا معيبا ، مع إسقاطات خاطئة محورية وفصوص MB مفقودة.

تحت المجهر ، استخدم ماصة P200 لنقل 10 إلى 15 دماغا مقطعا في نفس النمط الجيني إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر مملوء بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد مخفف في PTN. ثم احتضان الأدمغة لمدة 20 دقيقة مع التأرجح البطيء في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، اسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم قم بإزالة المثبت.

بعد ذلك ، قم بإجراء غسلتين سريعتين باستخدام 500 ميكرولتر من PTN لكل غسلة. تبادل PTN بمجرد أن تستقر الأدمغة في الأنبوب. بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث غسلات طويلة باستخدام PTN باستخدام التحريك اللطيف في درجة حرارة الغرفة.

بعد هذه الغسلات ، يمكن تخزين الأدمغة طوال الليل عند 4 درجات مئوية في PTN. بعد إزالة آخر غسول PTN ، احتضن الأدمغة في 0.5 مل من محلول المنع لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، وبتحريض لطيف. بعد إزالة محلول الحجب ، أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب ، واحتضن الأدمغة عند 4 درجات مئوية لمدة يومين مع تحريض لطيف.

قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي باستخدام فوج غسيل PTN المكون من 5 غسلات ، ثم قم بتطبيق الأجسام المضادة الثانوية. اسمح لهذه الأجسام المضادة بالتحتضن مع الأنسجة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة بينما تكون محمية من الضوء مع الهزاز.

بعد احتضان الأدمغة في محلول الأجسام المضادة الثانوية ، قم بتطبيق فوج غسيل PTN ، وقم بتغطية العينات بورق الألمنيوم بعد كل غسلة ، وانتهي بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف 75 ميكرولترا من وسيط التركيب الفلوري المضاد للبهتان وقم بتدفق الأدمغة والوسط داخل وخارج طرف الماصة مرة واحدة فقط. يمكن بعد ذلك لف الأنبوب بورق الألمنيوم وتخزينه عند 4 درجات مئوية لعدة أيام ، ولكن من الناحية المثالية ، استمر مباشرة في التركيب.

لتركيب الأدمغة ، قم ببناء شريحة جسر. ضع غطاءين أساسيين على بعد 1 سم تقريبا على شريحة موجبة الشحنة. تأكد من أن الشريحة الموجبة الشحنة متجهة لأعلى. بعد ذلك ، قم بلصق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر ، واترك الملمع يجف تماما قبل المتابعة.

بعد ذلك ، ضع الشريحة تحت مجهر مجسم ، وأدمغة الماصة والوسط في الفراغ بين الغطاء. تأكد من ضبط الإضاءة لتحسين تصور العقول.

بعد ذلك ، قم بسحب وسائط التثبيت الإضافية من الشريحة مع الحرص على تجنب الأدمغة. ثم قم بإزالة وسائط التثبيت الزائدة المتبقية. سيسمح ذلك بوضع الأدمغة بشكل أكثر دقة.

الآن باستخدام الملقط ، قم بتوجيه الأدمغة إلى نمط شبكي مع توجيه فصوص الهوائيات لأعلى. بعد ذلك ، ضع غطاء على الدماغ ، واستخدم طلاء الأظافر بالإصبع لإغلاق حواف الغطاء العلوي المرفقة بأغطية القاعدة. الآن ، قم بتحميل التجويف المركزي بوسائط تثبيت جديدة بالتنقيط ، مما يسمح بسحب الوسائط تحت الغطاء عن طريق الحركة الشعرية. عندما يمتلئ التجويف ، قم بإغلاقه تماما باستخدام طلاء أظافر شفاف.